WB技术服务报告模板

1、Western Blot 实验报告正式实验客户姓名:报告日期:一、客户样品及抗体登记1 .样品种属来源：2 .样品标记：组织细胞样品名称备注3.抗体名称：抗体来源：抗体Cat.及10t号:二、材料和方法1 .试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型 RIPA配方）BCA®白定量试剂盒2mg/m1 BSA标准品5X还原样品缓冲液10 x Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10XTBST pH8.0中分子量蛋白 marker （7条带）中分子量预染蛋白marker （7条带） 湿转缓冲液NC膜，0.45um孑L径Millipore丽春红染色液BSAAmrescoPMSFA

2、mresco蛋白酶抑制剂Roche磷酸酶抑制剂Roche脱脂奶粉伊利ECLMilliporeStripping buffer（抗体洗脱液）（抗体需要选择，选择后把多余的删除）山羊抗兔 IgG （H+D , HRPJackson山羊抗小鼠 IgG （H+D , HRPJackson兔抗山羊 IgG (H+D , HRPJacksonBeta-actin 兔多抗Beta-actin 鼠单抗Beta-tubulin 兔多抗Beta-tubulin 鼠单抗GAPDFfe多抗GAPDHt单抗2.实验仪器Fresco低温冷冻离心机ThermoMultiSkan3 酶标仪ThermoMini P-4 电泳槽

3、Cavoy湿转电泳槽Cavoy电泳仪Bio-Rad半干槽Bio-Rad水平脱色摇床其林贝尔酸度计 pH211Hanna电动组织匀浆器Fluka三、实验方法及结果3.1 蛋白抽提3.1.1 组织蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑 制齐IJ）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMS附液，PMS眼浓度1mM称取组织重量以重 量：裂解液体积=1:9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka电动组织匀浆器15000rpm转速进行匀浆，每次10s,间隔10s,进行三次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰 水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育 20min, 4

4、度离心，13000rpm, 20min。离 心完成后取上清，分装保存，待测。3.1.2 细胞蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑 制剂）。在蛋白抽提开始前加入 0.1M PMSFFS液，PMS照浓度1mM细胞计数，以细胞 数量1X107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min, 4度离心，13000rpm, 20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.2 BCA法蛋白定量准备BCAT作液A液：B液=50:1 ,稀释好各个提取BSA标准品。样品用PBS进行 稀释。样品：BCAT作液=1:8,混匀后37度孵育30min

5、或者室温孵育60min,酶标仪570nm 波长滤光片读取OCfi。蛋白浓度计算见下表:3.3 蛋白浓度调整以RIPA调整蛋白浓度，加入5X还原样品缓冲液后样品终浓度为 2-4mg/ml （不同 样品具体确定）。煮沸变性5min。样品蛋白浓度调整见下表：3.4 SDS-PAGE3.4.1 根据目的蛋白的分子量，配制12剂离胶，浓缩胶浓度为5%3.4.2 待检测蛋白样品上样量：上样20ug3.4.3 电泳条件：浓缩胶包压90V,约20min,澳酚蓝进行分离胶界面；分离胶包压160V,电泳至澳酚蓝到凝胶底部。3.4.4 用考马斯亮蓝染色液进行染色。染色结果见下图：3.5 目的蛋白WBE式实验3.5.

6、1 根据目的蛋白的分子量，配制分离胶，浓缩胶浓度为5%3.5.2 待检测蛋白样品上样量：3.5.3 电泳条件：浓缩胶包压90V,约20min；分离胶包压160V,通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。3.5.4 湿转法，转膜条件：300mAs流；0.45um孔径NC膜，转膜时间h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标记，准备预实验时进行 按照纵向泳道剪膜。3.5.5 封闭：将膜完全浸没5%兑脂奶粉-TBST中室温轻摇60min。3.5.6 一抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释稀释一抗,室温孵育10min,放4c过夜。膜编号一抗名称稀释比例稀释后体积备注：按

7、照预实验中确定的稀释度进行正式实验 选择一种内参进行同步预实验。3.5.7 第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST光月I 5次，每次3min。3.5.8 二抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG （H+D HRP山羊抗小鼠 IgG （H+D HRP, 1:10000,室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗月16 次，每次 3min。3.5.9 ECL加到膜上后反应3-5min ,胶片曝光：10s-5min （曝光时间随不同光强度而调整）， 显影2min,定影。胶片扫描后结果如下：3.6 内参蛋白WB£式实验3.6.1 Stripping Buffe

8、r 洗膜，37c洗膜30min （如果目的蛋白与内参蛋白分子量相 差在10K以上，可以不用stripping buffer洗膜这一步）。3.6.2 洗膜：去离子水洗膜3次。3.6.3 洗膜：TBST洗月13次，每次3min3.6.4 将膜完全浸没3%BSA-TBS中室温轻摇30min。3.6.5 孵育内参：加Beta-actin 兔多抗，用5%兑脂奶粉-TBST稀释抗体，1:3000稀释， 室温孵育2h。3.6.6 洗膜：TBST洗月15次，每次3min。3.6.7 二抗孵育：用5%兑脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG （H+D HRP山羊抗小鼠 IgG （H+D HRP, 1:10000 ,室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗月16 次，每次 3min3.6.8 洗膜：TBST洗月15次，每次3min