硫酸铵饱和溶液计算

1、四）抗原的分离与纯化从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的， 必须进一步分离纯化才能获得 纯品。 在生物大分子制备工作中， 分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。 对于 异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸， 提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖， 一般可用专一性酶水解、 有机溶剂抽提、 选择性分部沉淀等方法处理， 小分子物 质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。 而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之 间的分离， 情况则复杂得多， 主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、 等电 点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析

2、法等。其中盐析法、 等电点法、 结晶法用于蛋白、 酶的提纯较多； 有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯 较多；柱层析法、 梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。 本 节 侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙 述。1蛋白质分离纯化的一些方法（1）盐析法 原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早， 至今仍广泛使用的方法。 其原理是蛋白质、 酶在低盐浓度下 的溶解质随着盐液浓度升高而增加 （此时称为盐溶） ；当盐浓度不断上升时， 蛋 白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出， 称为蛋白质的盐析。 这一现象 是由于蛋白质分子

3、内及分子间电荷的极性基团有着静电引力， 当水中加入少量盐 类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响， 使蛋白质在水 中溶解度增大。 但盐浓度增加到一定程度时， 蛋白质表面的电荷大量被中和， 水 化膜被破坏， 于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。 盐析法就根据不同蛋白质和酶 在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯 化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25C时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0 C时饱和溶解度为3.9mol/L，即 676g/L），在

4、这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来， 而且硫酸铵 价廉易得， 分段效果比其他盐好， 不容易引起蛋白质变性。 应用硫酸铵时， 对蛋 白氮的测定有干扰， 缓冲能力比较差， 故有时也应用硫酸钠， 如盐析免疫球蛋白， 用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是 30E以上溶解度太低。其他的中性盐 如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好， 但也由于溶解度太低， 受温度影响大， 故应用 不广。硫酸铵浓溶液的pH在4.55.5之间，市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸， pH值往往降至4.5以下，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 硫酸铵饱和度计算法及加入方式：在分段盐析时， 加盐浓度一般以饱和度表示，饱

5、和溶液的饱和度定为 100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有 3 种。一是当蛋白质溶液体积不大， 所需调整的浓度不高时， 可加入饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵，热至 5060C保温数分钟，趁 热滤去沉淀，再在0C或25E下平衡12天，有固体析出时即达100%饱和度。 盐析所需饱和度可按下式计算：式中V及V0分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积， S2及S1分 别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体 积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于 2%故 可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分

6、增大时， 可 直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：式中X是将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量(g), G及A为常数，与温度有关。G在0C时为707, 20C时为0.29。为方便 起见，在室温及C时所需硫酸铵的饱和度可直接查表2-1、表2-2求出。表2- 1室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数0.100.20.250.300.350.400.450.50.550.600.650.700.750.800.850.900.951.000551131141752092422783123503904304745195606086577087600.1057671

7、181491822152502873253654054484945305856346850.202959901211541882252602983373794204655125596100.252960911231571922282653043453864304755215710.303061931251601952322703103513944394855330.3306294128163199235 275 3153584034494950.403163961311662052402803223654104580.45316498133169206245286330 3734200.532

8、63100135 172 211250292 3353800.533661011381762142552983440.633671031401792192613050.6534691051431822242670.7034701081461872280.7535721101491700.836731121520.8537751140.937762 938盐析时注意的几个问题1）盐的饱和度：盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到 浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋

9、白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质， 饱和度达 20%寸，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至 28%- 33%寸，优球蛋白析出；饱和度 再增至33%-50%寸，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时，白蛋白析出。用硫 酸铵不同饱和度分段盐析法，从牛胰中酸性提取分离可得到九种以上蛋白质及酶。2）pH值：在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出，因此，盐析时除 个别情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。3）蛋白质浓度：在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低，如血清球蛋白的溶度从0.5%增到3.0%时，需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%某一蛋白

10、质欲进行两次盐析时，第 1次由于 浓度较稀，盐析分段范围较宽，第2次则逐渐收窄，例如用硫酸铵盐析胆碱酯酶 时，第1次硫酸铵饱和度为35%S 60%第2次为40%g 60%蛋白质浓度高些虽 然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉作用的干扰。表2-2 0 C下由S1提高到S2时每100ml加固体硫酸铵的克数溶液饱区0C时所达到硫酸铵饱和度（%的原和202530 3540455055606570 7580859095100始饱度在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数和度010.113.16.119.22.25.29.132.36.39.n43.14

11、7.51.5560.65.69.(%6444 6816186 J66930757.910.13.16.19.22.26.29.33.36.40.44.48.52.57.61.66.8767926185446052105.38.110.13.16.20.23.26.30.33.37.41.45.49.53.58.62.999036174223617152.65.46.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.2200 :2.75.58.311.14.17.20.24.27.31.34.38.42.46.51.55.335716

12、29779272502.75.68.411.14.17.21.24.28.31.35.39.43.47.严5691507556823002.85.68.611.14.818.121.24.928.32.336.240.244.48.874553502.85.78.711.15.18.21.25.29.32.36.41.45.814841990312.15.18.22.25.29.33.37.41.4002.95.88.9037286568452.95.99.012.15.19.22.26.30.34.38.0360632235009.212.15.19.23.26.30.34.3.06.059408885503.06.19.312.716.119.123.527.331.36003.16.29.512.16.20.23.27.941996503.16.39.713.216.820.521.4700