酶法制备壳寡糖及其生物学功能_图文

1、第8卷第3期2010年5月生物加工过程Chinese Journal of B i op r ocess Engineering Vol .8No .3May 2010doi:10.3969/j .issn .1672-3678.2010.03.006收稿日期:2009-09-28基金项目:四川省教育厅青年基金资助项目(2006B112;成都医学院省级大学生创新性实验项目(CX200920作者简介:王亮(1987,女,四川巴中人,本科生,研究方向:生物技术;杨雨晗(联系人,讲师,E 2mail:weilai0517sina .com酶法制备壳寡糖及其生物学功能王亮,杨雨晗,吴东明,张涛(成都医

2、学院生物医学系,成都610083摘要:用正交试验方法考察温度、酶浓度、pH 对蜗牛酶降解壳聚糖的影响,筛选蜗牛酶降解壳聚糖的最佳反应条件,采用S DS -P AGE 方法分析降解产物,制备具有生物学功能的壳寡糖。用不同浓度的壳寡糖处理人肝癌HepG2细胞,观察细胞形态学变化,M TT 法检测壳寡糖对其增殖的影响,琼脂糖凝胶电泳检测DNA 变化,流式细胞术检测凋亡率(AR 。结果表明:蜗牛酶降解壳聚糖的产物主要是聚合度为4以上的寡糖,更多的接近壳六糖。最佳反应条件为pH 410、温度40、酶和底物质量比为450;壳寡糖质量浓度在24mg/mL 时,对HepG2细胞增殖有抑制效应,细胞经壳寡糖处理

3、48h 后,开始空泡化,DNA 出现明显的凋亡条带,AR 明显高于对照组。在最佳反应条件下蜗牛酶能较好地降解壳聚糖,制备的壳寡糖在一定浓度范围内能通过诱导HepG2细胞发生凋亡而抑制其增殖,其作用呈浓度依赖性。关键词:壳寡糖;凋亡;蜗牛酶中图分类号:R392112文献标志码:A 文章编号:1672-3678(201003-0028-07Enzyma ti c producti on of ch itooli gos acchar i de and its b i olog i ca l functi on sWANG L iang,Y ANG Yu 2han,WU Dong 2m ing,ZH

4、ANG Tao(School of B i omedical Sciences,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China Abstract:The hydrolysis of chitosan by snail enzy m es was investigated w ith orthogonal test in fact ors of temperature,enzy m e concentration and pH.S D S 2PA GE was used t o analyze the hydrolysates for p reparin

5、g chit ooligosaccharides w ith bi ological functions .W ith different concentrati ons of chit ooligo 2saccharide p rocessing of hum an hepatom a HepG2cells,morphological changes were observed,the p roliferati on activity byM TT assay and changes of DNA by agarose gel electrophoresis were detected,an

6、d follow ing fl ow cytom etry was used t o detect the apop totic rate (AR .The results showed that poly m erizati on degree of the m ajor hydrolysis p roducts was above 4.The op ti m al conditi ons for chi 2t osan hydrolysis were as foll ow s:pH 410,temperature 40,the rati o of enzy m e t o substrat

7、e 8100.W hen ch it ooligosaccharide concentrati on was 24m g /mL ,it affected H epG2cell p roliferation .A f 2ter treating H epG2cells w ith chitoosligoaccharide about 48h,the cells began t o vacuolization and DNA ladder strip appear d istinctly,AR was higher than control .Chitosan was hydrolyzed by

8、 snail enzy m e under the op ti m al conditi on on a certain concentrati on,and chitooligosaccharide inhibited the p roliferati on of HepG2cells .Key words:chit ooligosaccharide;apop t osis;snail enzy me壳聚糖是甲壳素脱N-乙酰基的化合物,具有生物可降解性、安全无毒、良好的生物兼容性1。但壳聚糖是长链大分子,生理条件下水溶性差,溶液黏度大,使其作为生物效应剂的应用受到很大限制2。壳寡糖是其降解产

9、物,相对分子质量小,水溶性好,易被分散和吸收,且许多生物学性质与壳聚糖相似,特别是聚合度为6左右的壳寡糖,有较强的生理活性和功能3,具有抗氧化4、抗肿瘤5、免疫增强6等活性,壳寡糖在体内治疗肿瘤时,不引起急性中毒以及体质量的迅速下降7,毒副作用较小,适用于临床治疗,也可作为食品添加剂和保健品,在食品、医药及化妆品领域有着广泛的应用。目前壳聚糖制备壳寡糖主要有2种方法:化学降解法(如酸解法和酶解法。化学降解法降解效果较好但得到较多的单糖产物,壳寡糖含量低。酶解法主要有专一性酶解和非专一性酶解,前者虽然对壳聚糖的降解专一性强,但目前获得壳聚糖酶菌株的产酶能力较低,且来源有限。非专一性酶,如木瓜蛋白

10、酶、脂肪酶等能在短时间内迅速降低壳聚糖黏度,得到较多的壳寡糖。单独使用1种非专一性酶制备壳寡糖报道很多,但是由于酶的非专一性,产品往往黏度较低,寡糖含量少,单糖多,产品质量不好,或者降解反应效率低,难以实际应用8。近年来,采用多种非专一性酶联合降解壳聚糖制备壳寡糖成为了研究的主流9。如蛋白酶、纤维素酶等联合应用,一方面能快速降低反应物壳聚糖的黏度,另一方面能获得大量生物活性高的聚合度为37的壳寡糖。但是这种方法必须使用多种酶,且各种酶之间必须考虑相互作用降解问题,应用上存在诸多限制。蜗牛酶是一种纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等构成的混合酶,是一种非专一性降解壳聚糖的混合酶,在食品医药工业上已

11、经得到广泛应用。本研究选用蜗牛酶降解壳聚糖,优化其反应条件,并以HepG2细胞为研究对象,通过体外实验探讨其生物学活性。1材料与方法111材料和仪器人肝癌细胞株HepG2,来自四川大学生物治疗国家重点实验室。壳聚糖(脱乙酰度90%,上海伯奥生物科技有限公司;蜗牛酶,Lüshengyuan B i otechnol ogy公司;壳寡糖、RNase A、蛋白酶K,Sig ma公司;盐酸氨基葡萄糖,中国医药集团上海试剂公司;DME M培养基,GI B CO BRL公司;小牛血清,成都榕海生物公司;噻唑蓝(MTT,Am resco公司;其余试剂均为国产分析纯。高速冷冻离心机,Eppendor

12、f公司;Am icon L tra-15超滤管(104,M illi pore公司;M I N I2PRO2 TE I N电泳系统,B i o2Rad公司;凝胶成像系统, Gene公司;流式细胞仪,BD F ACSCalibur T M Fl o w 公司;CO2培养箱,Thre mo公司;倒置相差荧光显微镜,O ly mpus公司;酶联免疫检测仪,B i oTek Power W ave XS2公司。112方法11211酶法制备壳寡糖1壳聚糖黏度的测定蜗牛酶液和质量分数1%的胶体壳聚糖液,按照酶与底物质量比1100混合后,于40、pH410条件下反应,分别在0、30、60、90、120、15

13、0m in测定其黏度,黏度测定方法选用乌氏黏度计法,以各时间点加空白缓冲液的壳聚糖溶液黏度作对照。2壳寡糖制备工艺取5mL1%壳聚糖醋酸(HAc溶液,加入蜗牛酶溶液和2mL0102mol/L的HAc2Na Ac缓冲液,于水浴锅中反应,期间不断振荡,反应2h后沸水煮沸10m in,再向其中加入015mL1mol/LNa OH溶液,4000r/m in离心5m in,然后取上清液于超滤管(104中,5000r/m in离心25m in,收集滤液测其糖含量,进行真空冷冻干燥。将得到的试样进行S DS-P AGE电泳。3酶降解的正交试验产物中还原糖的多少是壳聚糖降解程度的1个重要指示,降解越彻底,还原

14、糖量越高,因此采用还原糖的量来表征降解反应的程度。在蜗牛酶降解壳聚糖的过程中,影响产物中还原糖量的主要因素有:酶浓度、温度、pH。所以本实验建立三因素四水平的正交试验来找出蜗牛酶降解壳聚糖的最佳工艺条件。4S DS-P AGE不连续凝胶电泳检测壳寡糖参考文献10方法。取邻氨基苯甲酸0128g,硼氢化腈钠0163g溶于10mL水中,于65水浴中溶解(制得标记液,向试样中加入适当的标记液于65水浴中保温2h,待其冷却后加入6倍体积的乙腈, 12000r/m in离心10m in,弃上清,向沉淀中加入电泳试样缓冲液。92第3期王亮等:酶法制备壳寡糖及其生物学功能参考文献11方法。采用分离胶质量分数为

15、1715%、浓缩胶质量分数为3%的S DS2P AGE不连续凝胶电泳对壳寡糖进行检测。11212壳寡糖的生物学功能检测1壳寡糖溶液的配制按上述研究得到的最佳反应条件制备大量壳寡糖溶液,将降解产物进行真空冷冻干燥得到壳寡糖干粉。参考文献12方法。称取1、2、3、4g,分别溶于1L含10%小牛血清的DME M培养基中,制得质量浓度分别为1、2、3、4mg/mL的壳寡糖溶液。2MTT法检测壳寡糖对HepG2细胞增殖的影响参考文献13方法。收集对数生长期HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,以每孔410×103个细胞接种到96孔板,每孔体积200L,培养24h后,小心吸尽孔内培养液后,分别加入2

16、00L不同质量浓度的壳寡糖溶液:0(阴性对照组、1、2、3、4mg/mL (用药组,每个质量浓度作3个复孔。培养48h后,加入20L5mg/mL MTT,继续培养2h后,吸尽孔内液体,每孔加入150L DMS O,振荡10m in。在酶联免疫检测仪上,波长为492nm检测各孔光吸收值(A492。壳寡糖对HepG2细胞的抑制率按式(1计算:抑制率=(对照组A492-用药组A492/对照组A492×100%(13形态学的观察收集对数生长期HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,每孔以6×104个细胞接种到六孔板,培养24h后吸尽孔内培养液,分别加入质量浓度为0(对照组、4mg/mL(

17、实验组的壳寡糖溶液,培养48h后于倒置相差显微镜下观察。4荧光染色收集对数生长期HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,每孔以6×104个细胞接种到六孔板,培养24h后弃去孔内培养液,分别加入浓度为0 (对照组、4mg/mL(用药组的壳寡糖溶液,培养48h,吸尽孔内培养液。1mL磷酸盐缓冲液(P BS洗1次,再加入浓度为815g/mL吖啶橙(AO溶液2mL,室温避光染色10m in,荧光倒置相差显微镜下观察。5DNA琼脂糖凝胶电泳参考文献14方法。HepG2细胞分别经0(对照组、1、3、4mg/mL (用药组壳寡糖溶液处理培养48h后,收集1×107个以上的细胞,按比例每1

18、15;107个细胞加入200L细胞裂解液(pH810、5mmol/L Tris2HCl、1mmol/L EDT A、0125%NP-40,加入终质量浓度为200g/mL的RNase A,37孵育60m in,再加入终质量浓度为300g/mL的蛋白酶K,37孵育90m in,4冷冻离心,2000r/m in离心3m in,收集上清液。取上清液进行琼脂糖凝胶电泳,胶浓度为115%,50V电泳2h,溴化乙锭染色后,于凝胶成像系统在紫外灯下观察并成像。6P I染色分析法收集对数生长期HepG2细胞,调整细胞悬液浓度,每孔以110×105个细胞接种到六孔板,培养24h后,弃去孔内培养液,加入浓

19、度为0(对照组、4mg/mL(用药组壳寡糖溶液,培养48h后,胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,收集所有细胞,2000r/m in离心3m in,1mL预冷PB S 洗涤2次,收集细胞沉淀,加入1mL溴化丙啶(P I染色液,4避光保存30m in,流式细胞仪检测。2结果与讨论211乌氏黏度计法筛选酶法制备壳寡糖的时间乌氏黏度计法筛选酶法制备壳寡糖的时间如图1所示。由图1可知,在30m in时,壳聚糖反应液黏度下降了5811%。随着时间的延长,反应液黏度继续降低,在2h后其黏度趋向于稳定,几乎变化不大,故选用2h为反应时间 。图1蜗牛酶降解壳聚糖过程中黏度的变化F i g.1Changes of v

20、iscosity dur i n g the hydrolysisof ch itos an by s na il a se212正交试验确定最佳反应条件蜗牛酶降解壳聚糖正交试验结果及方差分析如表1表2所示。由表1和表2可知:P<0105,均具有统计学意义。得出最佳反应条件:温度40,酶和底物质量比为450,pH为410。因此采用此最佳反应条件制备壳寡糖。03生物加工过程第8卷表1蜗牛酶降解壳聚糖正交试验结果Table1O rthogona l tests and results for ch itos an hydrolysis w ith s na il a se序号温度/酶和底物的

21、质量比pHm(还原糖/mg1301503154167 2302504107187 330350415616 4304505108164 5401504156145 6402505109106 74035031514184 84045041032137 9501505103169 105025041513147 115035041018167 125045031513153 13601504108181 14602503154170 15603505104113 16604504158187表2方差分析结果Table2Results of var i a nce ana lysis误差源III型

22、平方和自由度均方F统计量显著性水平修正模型71473(a9018309183001006截距5613501561350667113101000温度211843017288161801014酶底比113953014655150501037 pH3189431129815136901003误差01507601084合计64133016校正总和7198015R2=01936(调整R2=01841213壳聚糖降解产物的电泳检测及其分析壳聚糖降解产物的电泳检测及其分析如图2所示。由图2可知,反应管1、2、7、8、11、12、13、14都能清晰看到5条亮带分别为单糖、壳二糖、壳三糖、注:A为单糖,D为壳寡

23、糖,116均为试样。图2S D S2PAGE电泳图F i g.2S D S2PAGE electrophoretogram壳四糖、壳五糖,降解产物中五糖以上的寡糖呈弥散状态分布,说明聚合度为5以上的寡糖在产物中的比例居多,是具有抗肿瘤活性的壳聚糖(聚合度4715。214壳寡糖溶液对HepG2细胞增殖的影响不同浓度的壳寡糖对HepG2细胞增殖抑制作用见图3。结果显示,低浓度的壳寡糖对HepG2细胞抑制作用较小,但随着浓度的增加,壳寡糖对13第3期王亮等:酶法制备壳寡糖及其生物学功能HepG2细胞的抑制作用呈浓度依赖关系,随着壳寡糖溶液浓度增加而增加,在质量浓度为4mg/mL 时,抑制率达到721

24、81%。经统计学分析,各用药组分别与对照组相比,用药组抑制率均具有统计学意义(P <0105。按照细胞存活率对剂量作图并按作图法求出药物半数抑制浓度(I C 50值为2161mg/mL 。215壳寡糖诱导HepG2细胞形态学变化4mg/mL 壳寡糖作用于HepG2细胞48h 后,细胞变圆变亮,膜皱缩,细胞表面产生许多泡状(图4。通过吖啶橙荧光染色法观察(图5,未经药物处理的细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光,给药组的细胞核染色质呈黄绿色,浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及圆形小体,初步判断为凋亡小体。壳寡糖的抗肿瘤机制主要是能通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而抑制其生长16。通过本实验研究结

25、果显示,壳寡糖能够抑制HepG2细胞的生长,且随着浓度的升高,抑制率呈递增趋势 。图3不同浓度壳寡糖对HepG2细胞增殖抑制情况F i g .3D i fferen t ch itooli gos acchar i de concen tra ti on sof soluti on on the role of HepG2cell proli fera ti on i n h i b itory图4形态学观察细胞变化F i g .4O bserva ti on of cell m orphology changes图5吖啶橙染色观察细胞变化F i g .5Acr i d i n e orang

26、e st a i n i n g cells216琼脂糖凝胶电泳分析DNA 变化特征凋亡细胞的一个典型特征是DNA 断裂成长度为180200bp 的整数倍,因此用琼脂糖凝胶电泳分析时DNA 呈“梯状条带”分布,结果如图6所示。由图6可知,HepG2细胞经各浓度梯度壳寡糖溶液处理48h 后提取DNA ,经琼脂糖凝胶电泳分析,各23生物加工过程第8卷 3期 第 王 亮等 : 酶法制备壳寡糖及其生物学功能 33 用药组 DNA 分布与对照组相比 , 均有“ 梯状条带 ” 出现 ,说明壳寡糖诱导 HepG2 细胞发生凋亡 。 注 : M marker; A 对照 ; B (壳寡糖 = 3 mg/mL;

27、 C (壳寡糖 = 4 mg /mL; D (壳寡糖 = 1 mg /mL 图 6 壳寡糖溶液对 HepG 2 作用 48 h 后的 D NA ladder图谱 F ig. 6 D ifferen t ch itooligosacchar ide concen tra tion s of solution on role of HepG 2 after 48 h of D NA ladder photography 图 7 流式分析壳寡糖对 HepG 2 细胞的凋亡作用 F ig. 7 Ch itooligosacchar ide flow ana lysis of HepG 2 cell a

28、poptosis 综上所述 ,本实验选用蜗牛酶在一定条件下降 解壳聚糖 , 能得到较多且具有抗肿瘤活性的壳寡 糖 ,经细胞生物学实验验证 , 具有较好的抗肿瘤活 性和一定的学术研究和经济价值 。 参考文献 : 1 刘清华 ,孔庆兖 ,柳红 . 壳寡糖对 S180 肉瘤细胞凋亡 、 细胞周 期以及凋亡相关蛋白 Bel - 2、 的影响 J . 徐州医学院学 Bax 报 , 2006, 26 ( 4 : 290 2 293. L iu Q inghua, Kong Q ingyan, L iu Hong Effects of chito 2 . oligosa2 ccharide oil tumo

29、r apop tosis, cell cycle and dlallges of apop tosis2re2 壳寡糖对 HepG 2 细胞的凋亡作用如图 7 所示 。 由图 7 可知 , HepG2 细胞经 4 mg /mL 壳寡糖溶液处 理 48 h ,与对照组相比 , 用药组有典型的 sub 2G1 后 亚峰出现 ,对照组凋亡率 ( AR 为 3181% , 而加药组 凋亡率 (AR 为 17141% ,说明壳寡糖能诱导 HepG2 细胞发生凋亡 。 蜗牛酶是一种由多种酶构成的混合酶 , 本研究 采用蜗牛酶降解壳聚糖制备壳寡糖 , 可以在仅采用 一种酶制剂的条件下达到多种非专一性酶降解的

30、 效果 ,有着极好的应用前景 。本研究结果表明 , 蜗 牛酶降解壳聚糖的产物主要是聚合度为 4 以上的壳 寡糖 ,更多的接近壳六糖 , 有效地减少了低聚合度 壳寡糖的生成 ,产品质量较进口产品更佳 。 倒置相差显微镜观察 、 荧光显微镜观察 、 DNA 琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞仪检测 , 均出现了明 显的凋亡特征 。验证了蜗牛酶制备的壳寡糖对肿 瘤细胞的促凋亡作用 。 217 流式细胞仪分析凋亡率 3 结 论 2 陈海燕 ,张彬 ,何勇松 . 壳寡糖的研究进展和应用前景 J . 广 3 陈虹 ,侯伟革. 壳寡糖及其应用 J . 饲料博览 , 2007 (11 : 23 2 24. view,

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35、日本开发出用芝麻成分检测自由基的方法 日本东京大学研究人员报告说 ,芝麻中含有的芝麻酚与自由基接触时 ,会发出荧光 ,他们据此开发出了 测定自由基的新方法 。自由基是机体细胞新陈代谢的副产物 , 过多自由基堆积体内 , 被认为是导致衰老及 诱发癌症 、 心脏病等疾病的重要因素 。芝麻酚本身不发光 , 但与自由基接触后 , 2 个芝麻酚分子会结合生成 二聚物 ,并发出荧光 。 研究人员在人体血浆中加入芝麻酚 ,然后用荧光亮度检测仪进行测定 , 结果发现能灵敏地检测出自由 基的存在 。 (文伟河 6 Feng J, Zhao L , Yu Q. Recep tor2 mediated stim u

36、latory effect of oli2 gochitosan in maerophages J . B iochem B iophys Res Comnun, 7 官杰 ,李殿俊 . 壳寡糖对肿瘤抑制作用试验研究 J . 医学研究 8 张虎 ,杜昱光 ,虞星炬 . 几丁寡糖与壳寡糖的制备和功能 J . 9 王杨 ,娄永江 ,杨文鸽 . 酶法制备几丁寡糖和壳寡糖研究现状 10 郭尧君 . 蛋白质电泳实验技术 M . 北京 : 科学出版社 , 1999: 11 Howard M B , Ekborg N A ,W einer R M , et al Detection and char2 .

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