谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

1、中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2006,27(1):5963谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除饶志明*张君胜 沈 微 方慧英 诸葛健(江南大学工业微生物中心工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214036)摘要 以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)标准菌株ATCC13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom),在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km),得到基因元件hom:Km;通过电击转化法将hom:Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转

2、化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g2hom:Km28发酵60h赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032(0.7g/L)的6.7倍。关键词 赖氨酸 高丝氨酸脱氢酶缺陷 谷氨酸棒杆菌中图分类号 Q814赖氨酸是人和动物所不能合成的8种必需氨基酸中最重要的一种。在食品和饲料中赖氨酸含量不足时会限制其他氨基酸的利用,发展赖氨酸生产对于提高食品中蛋白利用率,增强人民体质以及发展禽畜养殖业等具有十分重要的意义。工业上生产赖氨酸主要以发酵法为主。目前我国已有工厂利用发酵法生产赖氨酸,但由于还存在生产菌株产酸水平较低,生产规模较小,生产成本

3、较高、难以和进口产品竞争等问题,因此选育高产赖氨酸菌种的工作意义重大。赖氨酸发酵工业中常用的菌种主要为棒状杆菌属的各种突变株,传统育种是采用人工诱变的方法筛选出营养缺陷型和代谢类似物抗性的突变株。但是这种传统的营养缺陷型突变的产生是随机的,需要耗费大量的人力,并且极其费时1素抗性基因Km作为标记,再将其通过电击法转入谷氨酸棒杆菌,通过双交换替代菌株原有的hom,从而达到对原菌株hom的敲除,并通过PCR和发酵试验对高丝氨酸脱氢酶缺陷型菌株进行了验证。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 菌种与质粒 谷氨酸棒杆菌ATCC13032、大肠杆菌JM109、质粒pET28a、pUC18均为本实验室保

4、存;pGEM2Teasy载体购自Promega公司。1.1.2 主要试剂和工具酶 各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA胶回收和质粒快速提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;蛋白胨和酵母膏为OxoidLTDBASINGSTOKO公司产品;其他试剂均为国产分析纯。1.1.3 培养基 LB培养基(g/L):酵母膏5、胰蛋白胨10、NaCl10;MM培养基(g/L):葡萄糖20、MgSO4#7H2O0.2、NaNH4#4H2O3.5、K2HPO4#2H2O11.9、(NH4)2SO41、柠檬酸2;SM培养基(g/L):葡萄糖2

5、0、MgSO4#7H2O0.2、NaNH4#4H2O3.5、K2HPO4#2H2O11.9、(NH4)2SO41、柠檬酸2、高丝氨酸1;。高丝氨酸是赖氨酸合成途径中最重要的分支代谢产物,选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型菌株是赖氨酸高产菌株选育过程中极重要的一步2。最近,谷氨酸棒杆菌标准菌株ATCC13032全基3因组序列的完成为采用分子生物学手段改造氨基酸生产菌株创造了条件。本研究即根据公布的谷氨酸棒杆菌基因组序列设计引物,扩增获得了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因hom,在其中间插入一段卡那霉收稿日期:2006207226 修回日期:2006211229*国家自然科学基金资助项目(30570142)

6、*电子信箱:raozm60中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l27No.12007种子培养基(g/L):葡萄糖20、(NH4)2SO410、K2HPO41、MgSO4#7H2O0.4、FeSO4#7H2O0.01、MnSO4#H2O0.008、酵母膏5;发酵培养基(g/L):葡萄糖130、(NH4)2SO430、K2HPO41、MgSO4#7H2O0.4、FeSO4#7H2O0.01、MnSO4#H2O0.008、CaCO330、酵母膏3。1.1.4 引物合成 根据已公布的谷氨酸棒杆菌的基因组全序列,分别设计高丝氨酸脱氢酶基因hom两端的引物;P1:5cCGCGGATC

7、CGGGTGGCCGAAACAAGTAATTAGTCCCTTTCGAGGCGG3c;引物由北京三博远志生物公司合成。1.2 方 法1.2.1 谷氨酸棒杆菌染色体DNA的提取 参照参考文献4并稍有改动。1.2.2 hom基因的扩增 以谷氨酸棒杆菌染色体为模板,用引物P1、P2扩增hom基因;扩增循环条件:94e变性45s,52e退火90s,72e延伸90s,35个循环;扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3 质粒pUC182hom:Km的构建 将PCR获得的hom基因片段电泳胶回收后与pGEM2Teasy载体16e连接过夜,转化E.coliJM109,得到E.coliJM109(pG

8、EM2Teasy2hom)。重组质粒pGEM2Teasy2hom用EcoRI酶切,胶回收1.3kb的hom片段;同时质粒pUC18也用EcoRI酶切并胶回收其线性化片段;然后用T4DNA连接酶连接hom片段和pUC18线性化片段,连接产物转化E.coliJM109,得到E.coliJM109(pUC182hom)。将pET28a用NaeI酶切后胶回收其中大小约为1.6kb的包含Km抗性基因的片段,并将其与同样用NaeI酶切后的pUC182hom进行连接,得到pUC182hom:Km(图1)。图1 质粒pUC182hom:Km的构建Fig.1 ConstructionofplasmidpUC18

9、2hom:Km1.2.4 电击转化谷氨酸棒杆菌剂转化子的获得437e轻柔振荡培养1h,取200Ll涂布于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板30e培养至阳性转化子长出。1.2.5 阳性转化子的验证 将得到的阳性转化子分别点种于MM平板和SM平板对比培养,在MM平板上无法生长,在添加了高丝氨酸的SM平板上正常生长的初步认为是高丝氨酸缺陷菌株。提取转化子的染色体DNA用hom基因的引物扩增homJKm,进一步验证阳新鲜的对数期菌液培养至OD600约为0.4时迅速冰浴1530min,4e离心洗涤3次后用10%的甘油稀释为2310cell/ml。取40Ll细胞和2Llhom:Km片段混匀,冰上冷却1

10、min;迅速加入冰冷的电击杯电击,电击条件为电压2.5kV,时间5ms。脉冲结束后尽快取出电击杯,室温下加入1mlLB培养基,转移到离心管中82007,27(1)性转化子。饶志明等:谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除611.2.6 转化子发酵产酸测定 阳性转化子接种于种子培养基,在30e、200r/min的条件下摇床培养14h,按3%接种量接种到发酵培养基中,在30e、200r/min的条件下摇床培养60h后测定发酵液的赖氨酸含量。1.2.7 赖氨酸测定方法 采用茚三酮比色法测定5。2 结 果2.1 hom基因的扩增图2是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体为模板,以hom基因

11、引物PCR的电泳结果,从图上可以看出在1.3kb处有一条明亮的带,这与hom基因预期大小是相符合的。图2 hom基因的扩增Fig.2 Amplificationofhomgene1:KDNA/HindIII;2:homgene2.2 质粒pUC182homJKm构建及鉴定图3所示为hom基因与T载体连接后用EcoRI酶切后的凝胶电泳图,从图上可以看出在1.3kb处有一条明亮的带,证明hom与T载体连接成功。图4所示为hom与pUC18连接后用EcoRI酶切结果电泳图,在1.3kb与2.7kb处各有一条明亮的条带,验证了pUC182hom连接成功。图5所示是将pUC182homJKm用BamHI

12、酶切后的电泳图,从图上可以看出在2.3kb和3.3kb各有一条带,它们的和约为5.6kb,进一步表明pUC182homJKm构建成功。2.3 电击转化结果的鉴定以含有100mg/L卡那霉素抗性平板上筛选到的转化子分别点种于MM平板和SM平板对比培养,在MM平板上无法生长,在添加了高丝氨酸的SM平板上正常生长的初步确认为高丝氨酸脱氢酶缺陷菌株。以阳性转化子和对照菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,阳性转化子的原hom基因被含有Km片段长度大约为2.9kb的homJ图3 pGEMOTeasyOhomEcoRI酶切验证Fig.3 Electrophoresisof

13、pGEMOTeasyOhomdigestedwithEcoRI1:pGEMOTeasyOhomdigestedwithEcoRI;2:DNAMarker:DL2000图4 pUC18OhomEcoRI酶切验证Fig.4 ElectrophoresisofpUC18OhomdigestedwithEcoRI1:pUC18OhomdigestedbyEcoRI;2:DL2000图5 pUC18OhomJKmBamHI酶切验证Fig.5 ElectrophoresisofpUC18OhomJKmdigestedwithBamHI1:KDNA/HindIII;2:pUC18OhomJKmdigeste

14、dwithBamHIKm替换,而原始对照菌株hom基因长度约1.3kb,两者相差约1.6kb。如图6所示,说明阳性转化子已经成功62中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo.l27No.12007的用homJKm片段替换了原hom基因,初步达到了敲除hom基因的目的。法转入谷氨酸棒杆菌,通过双交换替代菌株染色体上原有的hom基因,从而达到对原菌株hom基因的敲除。并通过PCR对hom基因破坏的转化子进行了验证,进一步对hom基因破坏的转化子和原始出发菌株的赖氨酸发酵产量进行了测定,结果表明转化子的赖氨酸产量比对照得到了一定提高。据我们初步了解,这也是国内利用谷氨酸棒杆菌基因组信

15、息,通过分子生物学方法实现谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因敲除的首例报道。由于本研究所用的出发菌株谷氨酸棒杆菌为图6 hom基因缺失转化子的PCR鉴定Fig.6 PCRdeterminationresultsofthehomOdisruptedtransformants1:DL2000;2:PCRresultofC.glutamicum;35:PCRresultsofthehomOdisruptedtransformants;6:KDNA/HindIII2.4 发酵结果将得到的阳性转化子和对照菌株分别进行发酵实验,种子培养在30e200r/min培养12h后以3%接种量接种到发酵培养基,在30e

16、、200r/min的条件下发酵60h后测定发酵液的赖氨酸含量,结果表明其中一株转化子C.g2homJKm28的赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株(0.7g/L)的6.7倍。3 讨 论赖氨酸是天冬氨酸族氨基酸的一种,在谷氨酸棒杆菌产赖氨酸的代谢途径中,第一个分支代谢产物即是高丝氨酸,其代谢关键酶就是高丝氨酸脱氢酶,在该代谢途径中如果打断合成高丝氨酸的代谢途径,就可以使代谢流流向赖氨酸合成,从而达到增加赖氨酸产量的目的1。通常是采用诱变育种的方法获得高丝氨酸营养缺陷型,但由于突变的随机性和不确定性,因此要获得一株真正的营养缺陷型菌株常常要消耗大量的人力和物力。最近,谷氨酸棒杆菌标准菌株ATCC

17、13032全基因组序列的完成为采用分子生物学手段改造氨基酸生产菌株创造了条件3。本研究即根据公布的谷氨酸棒杆菌基因组序列,成功扩增获得了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因hom。然后通过分子生物学手段将来源于质粒pET28a中的一段卡那霉素抗性基因Km插入到hom基因内部,再将其通过电击氨基酸生产的模式菌株,本身未经过任何突变和育种改造,因此即使敲除了高丝氨酸脱氢酶基因后赖氨酸产量依然很低,但该研究所应用的技术和原理能够为相关的氨基酸生产菌株的分子育种提供一定的借鉴。目前我们正在利用谷氨酸棒杆菌基因组信息和相关的分子生物学技术对几个氨基酸的工业化生产菌株进行改造。参考文献1张克旭.氨基酸发酵

18、工艺学.北京:中国轻工业出版社,1992.423436ZhangKX.FermentationTechnologyofAminoAcid.Beijing:ChinaLightIndustryPress,1992.42324362龙万凯.赖氨酸工业生产菌的研究进展.食品与发酵工业,2003,29(9):7378LongWK.FoodandFermentationIndustries,2003,29(9):73783JornK,BrigitteB,DanielaB,etalThecompleteCorynebacteriumglutamicumATCC13032genomesequenceandi

19、tsimpactontheproductionofL2aspartate2derivedaminoacidsandvitamins1JournalofBiotechnology,2003,104:5254余秉琦,沈微,诸葛健.适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法.中国生物工程杂志,2005,25(2):7881YuBQ,ShenW,ZhugeJ.ChinaBiotechnology,2005,25(2):78815齐秀兰,阎浩林.L2赖氨酸高产菌株选育的研究.微生物学杂志,1997,17(2):1216QiXL,YanHL.JournalofMicrobiology,1997,1

20、7(2):12162007,27(1)饶志明等:谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除63DisruptionofhomGeneEncodingforHomoserineDehydrogenaseofCorynebacteriumglutamicumRAOZhi2ming ZHANGJun2sheng SHENWei FANGHui2ying ZHUGEJian(ResearchCentreofIndustrialMicroorganismsandTheKeyLabofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi 214036,China)Abstract T