L-天冬酰胺酶的生产工艺ppt课件

1、刘培培刘培培2021251341820212513418L-天冬酰胺酶的消费工艺天冬酰胺酶的消费工艺LOGO一天冬酰胺酶的化学组成和性质一天冬酰胺酶的化学组成和性质 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分别的酶类药物，用于治疗白血病。1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分别出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20储存7d，

2、5储存14d均不减少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30，60 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37。 二国内天冬酰胺酶的开展历程二国内天冬酰胺酶的开展历程 目前,国内临床上运用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开场消费E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶才干低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他缘由最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进展了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研讨,并初次在国内胜利构建了高效表达L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出

3、100 倍。随后又优化了基因工程菌的培育条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP 的纯化道路,并对重组产品进展了鉴定。结果阐明,基因工程菌消费的产质量量与天然品从基因序列、蛋白质一级构造到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 。这些研讨成果为我国工业化消费优质、低价的注射用E1coliL2ASP 开辟了新的道路。 三抗肿瘤机制 L2ASP 抗肿瘤的作用机制在于它可以降低人抗肿瘤的作用机制在于它可以降低人 体内体内L2天冬酰胺天冬酰胺和和L2谷氨酰胺的浓度谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成不能合成L2天冬天冬酰胺酰胺,需酸是合成嘌呤环和

4、嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才干存活。当外源天冬酰胺才干存活。当外源L2天冬酰胺被分解掉时天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和癌细胞合成核苷酸和蛋白质的才干就会显著降低蛋白质的才干就会显著降低,因此因此L2ASP 能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研讨阐明研讨阐明, L2ASP 可以选择性抑制体内可以选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值从而抑制肿瘤的增值 。另有文献报道。另有文献报道,L2ASP 在体内发扬作用时能够是经在体内发扬作用时能够是

5、经过一种功能性的过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 。四工艺流程 大肠杆菌产生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,没有抗肿瘤活性;而L2ASP 那么分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。现今,产生L2ASP 的菌种主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1

6、、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、浸透休克法以及亲和层析法等816 。采用不同方法最终得到目的产物的酶活力范围为220520217 U/ mg ,总回收率为31 %86 %。天冬酰胺酶工艺流程图天冬酰胺酶工艺流程图 大肠杆菌大肠杆菌 肉汤菌种肉汤菌种 种子种子菌种菌种 发酵液发酵液 菌体菌体 提提取液取液 上清液上清液 沉淀沉淀 洗脱液洗脱液 洗脱液洗脱液 冻干冻干 L-天冬酰天冬酰胺酶胺酶菌种培育肉汤培育基37 48h玉米浆培育基37 4-8h种子培育发

7、酵玉米浆培育基37 6-8h离心提取蔗糖抽提液PH7.5 30 分级沉淀NH4)2SO455饱和度PH7.0分级沉淀NH4)2SO490饱和度离子沉淀DEAE-纤维素(DE52)离子交换CM-纤维素(CM52)工艺过程及要点工艺过程及要点1 菌种培育菌种培育采用大肠杆菌采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培育基加牛培育基加牛肉汁肉汁100mL,蛋白胨蛋白胨1g,氯化钠氯化钠0.5g,琼脂琼脂2-2.5g 37,在在试管中培育试管中培育24h，茄形瓶培育，茄形瓶培育8h，锥形瓶培育，锥形瓶培育16h。2 种子培育种子培育培育基用玉米浆培育基用玉米浆30kg，加水至，

8、加水至300kg，接种量，接种量1%-1。5%，37，通气搅拌培育，通气搅拌培育4-8h.一、总述一、总述3 发酵罐培育发酵罐培育取玉米浆取玉米浆100Kg，接种量，接种量8%，37，通气搅拌培，通气搅拌培育育6-8h，离心分别发酵液，得菌体加，离心分别发酵液，得菌体加2倍量丙酮倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。4 蔗糖溶液抽提蔗糖溶液抽提将菌体细胞中参与将菌体细胞中参与5倍体积的蔗糖溶液蔗糖倍体积的蔗糖溶液蔗糖40%溶菌酶溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振振荡荡2h,8000r/min离心，收取上层酶

9、液。离心，收取上层酶液。5 硫酸铵分级沉淀取上述酶液，参与NH4)2SO4至55%饱和度，调PH至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液参与NH4)2SO4到90%饱和度，离心搜集沉淀。6 纯化将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶解并透析，透析后的酶液，经过预先用10mmol/L，PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱1cm30cm,用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40mL/h,搜集天冬酰胺酶活性组分，再调整PH4.8,经过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱1cm8cm,用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱，搜集

10、酶活性组分，冷冻枯燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220U/mg蛋白。二、工艺流程图二、工艺流程图v 1 1丝状菌三级发酵工艺流程丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管冷冻管2525C C，孢子培育，孢子培育，7 7天天斜面母瓶斜面母瓶2525C C，孢子培育，孢子培育，7 7天天大米孢子大米孢子2626C C，种子培育，种子培育56h56h一级种子培育液一级种子培育液2727C C，种子培育，种子培育，24h24h二级种二级种子培育液子培育液27262726C,C,发酵发酵,7,7天天发酵液。发酵液。2 2球状菌二级发酵工艺流程球状菌二级发酵工艺流程冷冻管冷冻管2525C C，孢子

11、培育，孢子培育，6868天天亲米亲米2525C C，孢，孢子培育，子培育，810810天天消费米消费米2828C C，孢子培育，孢子培育，5660h5660h种子培育液种子培育液2625-242625-24C C，发酵，发酵，7 7天天发酵液。发酵液。三、青霉素发酵过程三、青霉素发酵过程v 青霉素发酵时，青霉素消费菌在适宜的培育基、青霉素发酵时，青霉素消费菌在适宜的培育基、PHPH、温度和通、温度和通气搅拌等发酵条件下进展生长并合成青霉素。气搅拌等发酵条件下进展生长并合成青霉素。v 发酵开场前，有关设备和培育基主要是碳源、氮源、前体和发酵开场前，有关设备和培育基主要是碳源、氮源、前体和无机盐等

12、必需先经过灭菌，后接入种子。无机盐等必需先经过灭菌，后接入种子。v 在整个过程中，需求不断通气和搅拌，维持一定的罐温暖罐压，在整个过程中，需求不断通气和搅拌，维持一定的罐温暖罐压，在发酵过程中往往要参与泡沫剂，假设酸碱控制发酵液的在发酵过程中往往要参与泡沫剂，假设酸碱控制发酵液的PHPH，还需求间歇或延续的参与葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及还需求间歇或延续的参与葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的消费。氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的消费。青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。v菌体生长阶段：发酵培育基接种后消费菌在适宜的环境菌体生长阶段：发酵培育基接种后消费菌在适宜的环境中经过短时间的顺应，即开场发育、生长和繁衍，直至中经过短时间的顺应，即开场发育、生长和繁衍，直至到达菌体的临界浓度。到达菌体的临界浓度。 v青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的消费速率到达最大，并不断维持到青霉素合成才干