氧化应激对内皮细胞NFκB、iNOS和NO信号表达的影响

1、氧化应激对内皮细胞NFB、iNOS和NO信号表达的影响         10-11-15 11:20:00     编辑：studa20                   作者：何姜 陈闽 刘小莺 王燕萍 刘礼斌【摘要】  目的 观察氧化剂第三丁基过氧化氢(tBHP）对体外培养的内皮细胞

2、存活率及核转录因子B（NFB）、iNOS和一氧化氮（NO）的影响。 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），用不同浓度的tBHP处理，具体如下：（1）检测细胞存活率。tBHP作用浓度分别为12.5，25，50，100 mol/L，作用时间分别为30，60，90，120 min，采用MTT法观察；（2）检测NFB p65、iNOS蛋白表达量及细胞内NO水平。tBHP的作用浓度为50 mol/L，作用时间分别为30，60，90，120 min，采用Western blot测NFB p65、iNOS蛋白表达量，Griess化学显色法测细胞内NO水平；（3）iNOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯（LN

3、AME，600 mol/L）预处理内皮细胞24 h，用Griess化学显色法检测细胞内NO水平。 结果 tBHP可降低内皮细胞的存活率，且呈时间及剂量依赖性，50 mol/L tBHP作用30 min细胞核NFB活化片段p65蛋白表达达高峰，作用60 min细胞质iNOS蛋白达高峰；iNOS抑制剂LNAME可明显抑制内皮细胞NO升高。 结论 氧化应激可引起内皮细胞损伤，其效应可能通过NFBiNOSNO途径介导。 【关键词】  第三丁基过氧化氢； 脐静脉内皮细胞； 氧化损伤；核因子B； 诱导型一氧化氮合酶； 一氧化氮Effects of Oxidative Stress on NFB,

4、 iNOS and NO in Endothelial CellsHE Jiang, CHEN Min, LIU Xiaoying, WANG Yanping, LIU LibinFujian Institute of Endocrinology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical Universiy, Fuzhou 350001ABSTRACT:  Objective  To explore the effects of Tertbutyl hydroperoxide(tBHP) on NFB, iNOS and

5、NO in human umbilical vein endothelial cells.  Methods  Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro.  Cells viability was measured by MTT assay.  Nitric oxide levels were measured by Griess assay.  Inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and NFkBP65

6、fragment were detected by Western blot.  Results  Cell viability was reduced in a timeanddosedependent manner after exposure to tBHP at a range of 12.5100 mol/L for 30120 min.  The levels of cytoplasmic iNOS protein were elevated and reached a peak at 60 min.  The expression of n

7、ucleus NFkB p65 fragment reached a peak at 30 min after the treatment with tBHP.  The levels of Nitric oxide were markedly attenuated after the treatment with LNAME 600 mol/L for 24 hours.  Conclusion  NFBiNOSNO signalling pathway can mediate tBHP induced damage in human umbilical vei

8、n endothelial cells.    KEY WORDS:  Tertbutyl hydroperoxide; human umbilical vein endothelial cell; oxidative damage; nuclear factorB; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide    血管内皮细胞参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动，内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用1。现已明确氧化应激增强及氧自由

9、基激活会引起内皮细胞功能的障碍，但其分子机制尚不清楚2。已知核转录因子B（NFB）参与调控动脉粥样硬化发生的多种基因表达，而肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1（IL1）等细胞因子均为NFB的有效激活物，由此推测氧化应激可能是通过NFB介导内皮细胞损伤3。本研究采用氧化剂第三丁基过氧化氢(tBHP）诱导内皮细胞氧化损伤，观察内皮细胞存活率、细胞核NFB、细胞质iNOS蛋白及胞内NO水平的变化，探讨氧化应激对内皮细胞损伤作用及其信号通路。1  材料与方法1.1  药物及试剂 tBHP(CH3)3COOH、DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），四甲基偶氮唑蓝

10、（MTT）、左旋硝基精氨酸甲酯（LNAME，美国Sigma公司），NFB p65多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），iNOS多隆抗体（美国Millipore公司），actin单克隆抗体（武汉博士德公司），一氧化氮试剂盒（厦门碧云天生物技术研究所），Western blot化学发光检测试剂盒（厦门天根生化科技有限公司）。1.2  细胞培养与处理 选第58代人脐静脉内皮细胞（HUVEC，上海拜力生物有限公司），用含10%的胎牛血清（FBS）的改良Eagle培养基（DMEM）在37 、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，约80%细胞汇合时消化。6孔板每孔接种细

11、胞5×105 mL-1，培养16 h后，用不同浓度的tBHP处理，对照组以新鲜无血清培养液培养。于规定时间检测NFB、iNOS和NO等各项指标。1.3  细胞存活率MTT法测定 取上述培养的细胞接种于96孔培养板中，每孔100 L，共5×104个细胞，不同浓度（12.5，25，50，100 mol/L）的tBHP作用30，60，90，120 min，每孔加5 mg/mL MTT溶液10 L，37 孵育4 h，加DMSO终止孵育，495 nm波长测定各孔吸光度A值，计算细胞存活率，实验重复3次。1.4  NFB p65及细胞质iNOS蛋白测定&#

12、160;经50 mol/L的tBHP作用30，60，90，120 min后的HUVEC，分别作以下处理：（1）一部分HUVEC先用裂解缓冲液Ammol/L，HEPES 10（pH 7.9），KCL 10，EDTA 0.1，EGTA 0.1，DTT 1，PMSF 0.5400 L冰上裂解细胞15 min，加入10% NP40（终浓度0.2%）震荡20 s，6 000 r/min 4 离心5 min，将沉淀重悬于50 L裂解缓冲液Bmmol/L，HEPES 20（pH 7.9），NaCl 0.42，MgCl2 1.5，EDTA 1，EGTA 1，DTT 1，PMSF 1，冰上震荡20 min，14

13、 000 r/min 4 离心5 min，上清液留测NFB p65。（2）另一部分HUVEC用细胞裂解缓冲液mmol/L，TrisHCL 10（pH 7.4），NaCl 100，EDTA 1，EGTA 1，NaF 1，Na4P2O7 20，Na3VO4 2，0.1% SDS，0.5%(W/V)sodium deoxycholate，1%TritonX 100，1 mmol/L PMSF，60 g/mL aprotinin，10g/mL leupeptin120 L冰上裂解细胞20 min，将细胞刮下，混匀后4 14 000 r/min离心15 min，吸取上清液，留测iNOS。（3）用BCA法蛋白定量并配平各上清液浓度，取配平后的各上清液35 g，10% SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干电转移法将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，室温封闭12 h后加入1500的NFB p65一抗及11 000的iNOS一抗，4 孵育过夜后用12 000稀释的辣根过氧化物酶耦联的抗兔IgG二抗室温下反应2 h，化学发光法显色，X射线曝光底片。以actin作为内参照，实验重复3次。1.5  NO测定 应用Griess反应检测亚销酸根（Nitrite），可代表产生的NO的相对量。HUVEC经50 mol/L tBHP作用不同时间30