纳米羟基磷灰石_壳聚糖_明胶复合微球的制备及性能_图文

1、中国组织工程研究与临床康复 第 13 卷 第 16 期 20090416 出版 April 16, 2009 Vol.13, No.16 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research 基础实验 纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的制备及性能* 黄大建，张文熊，刘晶冰，井 淇 Preparation and performance of nanohydroxyapatite/chitosan-gelatin composite microspheres Huang Da-jian, Zhang Wen-xiong,

2、 Liu Jing-bing, Jing Qi Abstract BACKGROUND: Hydroxyapatite/polymer composite materials have been widely reported as tissue engineering materials; however, they are limited in repairing treatment because of the powder or piece in shape. OBJECTIVE: To prepare the nanohydroxyapatite (HAP/chitosan-gela

3、tin (CG composite microspheres, and to observe the general drug release in vitro. DESIGN, TIME AND SETTING: Repeated measurement study was performed at Laboratory of Biological Functional Polymer, College of Material Science and Chemical Engineering, Beijing University of Technology between January

4、and October 2008. MATERIALS: Nanohydroxyapatite, chitosan, gelatin, and gentamicin were used in this study. METHODS: Microwave irradiation method was used to synthesize aciform hydroxyapatite (pH=7, and W/O combined with multiple emulsification chemical crosslink technique was used to prepare nanohy

5、droxyapatite/chitosan-gelatin composite microspheres. MAIN OUTCOME MEASURES: Surface morphology and particle diameter distribution; drug loading, entrapment efficiency, and cumulative release rate. RESULTS: The composite microspheres were spherical in shape, and the particle diameter ranged from 10

6、to 30 m. Hydroxyapatite was greatly embedded by chitosan-gelatin. The average drug loading was 32.97%, the average entrapment efficiency was 49.20%, and the cumulative release rate to gentamincin was near 88% within 3 days. CONCLUSION: The composite microspheres exhibit well-distributed morphology,

7、narrow particle diameter distribution and good redispersibility. They can maintain an therapeutic concentration within 3 days. Huang DJ, Zhang WX, Liu JB, Jing Q.Preparation and performance of nanohydroxyapatite/chitosan-gelatin composite microspheres.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kan

8、gfu. 2009;13(16: 3097-3100. College of Material Science and Chemical Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China Huang Da-jian, Studying for masters degree, College of Material Science and Chemical Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China Correspo

9、ndence to: Zhang Wen-xiong, Doctor, Professor, College of Material Science and Chemical Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 50602002* Received: 2009-01-15 Accepted: 2009-03-09 摘要 背景：羟基磷灰石与高分子复合材料作为组织

10、工程材料的报道很多，但多为粉体材料或块状材料，用于修复治疗时均存在 一定的局限性。 目的：制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合缓释微球，观察其体外释药特性。 设计、时间及地点：重复测量设计，于 2008-01/10 在北京工业大学材料科学与工程学院生物功能高分子实验室完成。 材料：纳米羟基磷灰石、壳聚糖、明胶、庆大霉素。 方法：利用微波辅助法，在 pH=7 的条件下，制备了针状羟基磷灰石。采用 W/O 型复乳化-交联技术制备纳米羟基磷灰石/ 壳聚糖-明胶载药复合微球。 主要观察指标：纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的表面形貌、粒径分布。载药复合微球的载药量、包封率及药 物累积释放率。 结果

11、：纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶载药复合微球形态均匀，其粒径主要集中在 1030m，壳聚糖-明胶对羟基磷灰石 形成了很好的包覆。复合微球平均载药量 32.97%，平均包封率 49.20%，在 3 d 内对庆大霉素的释放达到 88%左右。 结论：所制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶载药复合微球形态均匀，粒径分布窄，再分散性好，3 d 内能维持有效的药物 浓度。 关键词：纳米羟基磷灰石；壳聚糖；明胶；庆大霉素；骨修复 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.16.021 黄大建，张文熊，刘晶冰，井淇.纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的制备及性能J.中国组织工程研究与临

12、床康复， 2009，13(16:3097-3100. 北京工业大学材 料科学与工程学 院 ， 北 京 市 100124 黄大建，男， 1979 年生，河南 省开封市人， 北京 工业大学材料科 学与工程学院在 读硕士， 主要从事 生物高分子材料 研究。 Huangdajian 1998 通讯作者：张文 熊，博士，教授， 北京工业大学材 料科学与工程学 院 ， 北 京 市 100124 国家自然科学基 金 资 助 项 目 (50602002* 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (200916-03097-04 收稿日期： 2

13、009-01-15 修回日期： 2009-03-09 (20090115011/M·H 机材料来说，羟基磷灰石有很高的化学稳定性 0 引言 羟基磷灰石是一种微溶于水的弱碱性磷酸 的钙盐，其化学式为Ca10(PO46(OH2，是人体 骨骼组织主要的无机成分，植入体内后在体液 的作用下，钙和磷会游离出材料表面被机体组 织所吸收，并生长出新的组织。相对其他的无 和耐磨性，而且具有良好的生物活性和生物相 容性，因而它是很有潜力的生物材料之一1-2。 但是羟基磷灰石的脆性较大， 韧性较低。 目前， 提高羟基磷灰石力学性能的主要方法是将羟基 磷灰石和其他高分子材料复合3-5。 壳聚糖是甲壳素脱乙

14、酰基得到的含氮碱 性多糖，具有良好的化学物理性能，在体内有 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 3097 www.CRTER.org 黄大建，等. 纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的制备及性能 良好的组织相容性、无毒性、可被吸收，广泛应用于 药物缓释、控释以及组织工程中 。明胶是胶原水解 的产物，它保留了胶原的化学结构组成，是由多种氨 基酸组成的聚合物，具有良好的生物相容性和生物降 解性能 7。 羟基磷灰石与高分子复合材料作为组织工程材料 的报道很多，但多为粉体材料或块状材料。例如： Rodrigues等 制备了胶原和羟基磷灰石复合粉体材料，

15、 并研究了其生物性能。Ge等 制备了块状壳聚糖和羟基 磷灰石复合组织工程支架材料。但粉体作为骨修复材料 注入时，由于彼此堆积紧密，可能在治疗过程中会出现 不良反应；而块体材料对于微创修复治疗时有其应用上 的局限性。 实验利用乳化 - 交联法制备了羟基磷灰石/壳聚糖明胶复合载药微球，作为骨修复材料应用时既克服了粉 体材料的密堆积，又可以在微创修复时使用，同时装载 的抗生素药物可以防止骨伤的感染。因此可以作为一种 潜在的具有多功能的骨修复材料。 1 材料和方法 设计：重复测量设计。 时间及地点：实验于2008-01/10 在北京工业大学 材料科学与工程学院生物功能高分子实验室完成。 材料： 试剂及

16、仪器 壳聚糖 明胶 JEOL-JEM 2010F 型透射电子显微镜 Winner2000 激光粒度分析仪 QUANTA 200 型扫描电子显微镜 Nicolet 5700 型傅里叶 变换近红外光谱仪 UV-3101PC 型紫外可见光分光光度计 Morphologi G2 颗粒图像分析仪 D/MAX-3C X 射线衍射仪 英国 Malvern 公司 日本 Rigaku 公司 日本 SHIMADZU 公司 济南纳微仪器有限公司 荷兰 FEI 公司 美国 Thermo 公司 来源 国药集团化学试剂有限公司 天津市福晨化学试剂厂 日本理学公司 9 8 6 散在壳聚糖溶液中；明胶加入水中并加热到70 得

17、到 70 g/L的明胶溶液，冷却至40 ；将2种溶液各取5 mL 等体积混合，搅拌均匀。在200 mL烧杯中加入100 mL 液体石蜡，1 mL Span80，一定速度磁搅拌下逐滴加入 壳聚糖/明胶溶液10 mL， 使水油比达110， 下快 50 速搅拌，乳化15 min后，迅速在05 冰浴15 min，加 入10 mL异丙醇分散10 min，逐滴加入1.0 mL 250 g/L 戊二醛于乳液中， 使微球交联固化3 h。 反应完成用3 号 砂芯漏斗真空抽滤，用异丙醇、无水乙醚反复冲洗，所 得微球置于50 电热恒温鼓风干燥箱中干燥即得复合 微球。 复合微球的表征：取制备的复合微球样品用颗粒图像

18、分析仪观察整体形貌；并用扫描电镜观察微球的表面形 态；将复合微球分散后，应用Malvern激光粒度分布测 试仪测定其粒径分布；KBr压片法制样，傅里叶转换红 外光谱仪测定样品的傅里叶转换红外光谱。 复合载药微球的制备： 采用浸泡载药法制备载药微球， 即先制备好复合空白微球，再将微球浸泡在溶有庆大霉 素的介质溶液中而成。在实验中采用的介质是pH为7.4 的磷酸盐缓冲溶液。 载药微球的载药性能及其释放行为检测： 载药量的测定：称取0.1 g空白微球置10 mLPBS溶 液中(包含庆大霉素0.1 g， pH为7.4； 在37 浸泡48 h， 然后将PBS和微球悬浊液取出并离心除去微球得澄清 液； 在

19、波长257 nm下进行紫外荧光(UV分析， 通过式(1 及式(2求得载药量及药物包封率。 载药量= (投药量-未包封在微球内的药量/微球总质量×100% (1 药物包封率=(投药量-未包封在微球内的药量/投药量×100% (2 累计释放量的测定： 称取0.2 g载药微球装入透析袋 中，放入20 mL缓冲溶液中，在37 下恒温水浴振荡。 每 隔 一 定 时 间 取 出 1 mL 并 补 充 相 同 体 积 缓 冲 液 ， 257 nm下进行紫外荧光分析，根据式(3累积释放百分 率。 累积释放百分率=微球释放到介质中的累积药量/微球总药量×100% 实验过程： 纳米羟

20、基磷灰石的制备及表征：根据本实验室前期工 (3 主要观察指标：纳米羟基磷灰石及纳米羟基磷灰 石/壳聚糖-明胶复合微球的表面形貌。复合微球的粒 径分布。复合微球的红外光谱。载药复合微球的载 药量、包封率及药物累积释放率。 设计、实施、评估者：为第一作者。 2 结果 见图1。 110004 作：将50 mL 0.1 mol/L Ca(NO32·4H2O溶液加入到 50 mL 0.06 mol/L Na2HPO4溶液中，搅拌5 min，其 pH=7。将溶液放入家用微波炉中，在260 W功率下反应 10 min，然后用去离子水洗涤，滤液pH值为7，将过滤 后的产物在70 下烘干。 分别用X射

21、线衍射仪和透射电 镜对样品进行物相分析和形貌观察10。 复合微球的制备： 将壳聚糖溶于50 g/L的醋酸溶液中， 得到30 g/L的壳聚糖溶液；取0.2 g羟基磷灰石，超声分 3098 2.1 羟基磷灰石的X射线衍射分析 P.O. Box 1200, Shenyang 黄大建，等. 纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的制备及性能 www.CRTER.org 合微球的红外光谱，其中的564，602，964，1 380 cm-1 为PO43-的吸收峰，而在1 650 cm -1和1 600 cm-1处的吸 收分别为仲酰胺的酰胺带吸收(即C=O的伸缩振动吸 Intensity (a.u. 收和N-

22、H的弯曲振动吸收， 说明壳聚糖分子还存在一定 数量的乙酰基，而在3 450 cm-1附近出现的吸收峰归属 为O-H及-NH2的N-H伸缩振动吸收；明胶是一种多肽混 合物，在红外光谱图中其特征吸收峰分别是：酰胺带 (1 663 cm-1 , 酰 胺 带 (1 546 cm-1 和 酰 胺 带 10 20 30 40 2 (° 50 60 (1 236 cm -1。以上各个特征峰的存在证明了复合体系 含有羟基磷灰石和壳聚糖-明胶成分。 2.4 复合微球的粒径分析 复合微球的粒径呈正态分 布，见图4。 Figure 1 X-ray diffraction patterns of hydro

23、xyapatite 图 1 羟基磷灰石样品的 X 射线衍射图谱 由图1可见，羟基磷灰石的各衍射峰的位置都与标 准卡片(JCPDS73-0293对应，说明最终产物均为羟基 磷灰石粉末，没有发现其他杂质峰。 2.2 羟基磷灰石的透射电镜分析 见图2。 Frequency (% 0.1 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0 0.57-0.69 3.98-4.83 27.63-33.54 192.00-233.07 1 10 100 1 000 Range of particle diameter (m Figure 4 Figure 2 Transmission electron mi

24、crographs of hydroxyapatite crystals 图 2 羟基磷灰石粉末的透射电镜照片 Distribution of laser particle diameter of composite microspheres 图 4 复合微球粒径的激光粒度分布 图4结果表明，复合微球粒径范围3.9827.63 m， 微球粒径分布较窄、大小比较均匀。 2.5 复合微球的形貌分析 见图5。 从图2中可以看到，当初始溶液pH值等于7时，样 品都为针棒状。 样品的长径比为3.04.0， 平均直径及长 度分别为30 nm和100 nm；且分散度较好。 2.3 复合微球的红外分析 见图3

25、。 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 4 000 a Transmittance (% a: Composite microspheres b b: Single microsphere Figure 5 3 000 2 000 1 000 Wave number (cm-1 a: Hydroxyapatite; b: Nanohydroxyapatite/chitosan-gelatin composite microsphere Optical micrographs and scanning electron microscopy examinat

26、ion of the composite microspheres 图 5 复合微球的光学显微镜以及扫描电镜图 Figure 3 Fourier transform infrared spectroscopy spectra of the two samples 图 3 不同样品的 FTIR 谱 其中图5a为复合微球的光学照片， 可以看到微球球 体均匀，无粘连现象，大小比较均匀；图5b中为单个微 球的扫描电镜照片，可以进一步看到微球表面较为圆整 光滑，且微球分散良好，粒径尺寸较小，无大块团聚现 象。图中衬底显示的颗粒状团聚物为测试平台上导电胶 的表面，并不影响微球表面形貌的观察。 3099 图

27、3a为羟基磷灰石的红外图谱， 在474， 571， 601， 962和1 0321 087 cm-1处都存在明显的吸收峰，对应 于PO43-；表征羟基磷灰石生成的OH-1 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R 吸收峰在630和 3 570 cm 处出现。图3b为羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复 CODEN: ZLKHAH www.CRTER.org 黄大建，等. 纳米羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的制备及性能 2.6 复合微球的载药量、包封率及体外释药 共制得 3.3 关于微球的药物缓释 高分子微球和微囊在医学 3批复合微球， 平均载药量32.97%， 平均包封率49.20%。

28、复合微球在3 d内的体外累积释药分数为0.875 6，释药 平稳。见图6。 100 80 Drug release (% 60 40 20 0 工程中起着重要的作用，很多药物无法直接使用，或者 直接使用效果不明显，需要用高分子材料来包埋药物， 并通过合理地设计微球和微囊尺寸、表面性质、缓释性 能等来达到在所需的时间、所需的地点，以及所需的速 度释放出药物12-15。 在临床骨创伤的实例中，由于伤口附近的血液循环 系统被破坏，常伴随着伤口的感染；为了治疗或预防这 种感染，常常要注射一些抗生素药物。在实验中，设计 在微球中加入抗生素庆大霉素，一方面可以预防感染， 同时因为药物在高分子载体中，可以起

29、到缓释的效果。 在微球载药量的测定中， g空白微球可以装载庆大霉 0.1 素49.20 mg，据公式可得载药量为32.97%。从图6可以 知道庆大霉素在3 d内都可以保持有效浓度。 实验制备的羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合微球的质 地均匀无粘连，粒径分布窄，再分散性好，各项指标基 本达到预期要求，且对庆大霉素用一定的缓释作用，可 用于进一步的骨修复的实验研究。 4 参考文献 0 12 24 t/h 36 48 60 72 Figure 6 Cumulative release curve of gentamicin- hydroxyapatite/chitosan-gelatin composi

30、te microspheres in phosphate buffer solution (pH 7.4 at 37 图 6 庆大霉素-羟基磷灰石/壳聚糖-明胶载药复合微球的累 积释放曲线(pH 7.4 的磷酸盐缓冲液，37 3 讨论 1 2 3 4 5 6 7 3.1 关于复合微球的制备 近年来，有机-无机复合微 球的制备越来越受到关注，这是因为有机-无机复合微 球既具有有机材料的可塑性、易加工性以及生物兼容 性，又具备无机物的刚性、磁性等性能；同时可实现对 药物的控制释放。 本实验采用了类似于Denkbas的方法并加以改进， 利用壳聚糖-明胶包埋了纳米羟基磷灰石颗粒，得到的 微球粒径较为均

31、一， 分散性较好。 制得的微球作为骨修复 组织工程材料使用时，由于微球的平均直径为18 m左 右，体积较小，可以以注入的方式治疗；同时微球之间 不会像纳米微粒一样形成紧密堆积，避免了不良反应的 发生，是一种较为理想的骨修复材料。 3.2 关于羟基磷灰石的分散 从仿生学角度出发，应当 保持骨替代物中羟基磷灰石呈纳米状态， 所以在制备骨修 复材料时应尽可能避免羟基磷灰石颗粒发生团聚 11 8 9 10 11 12 13 。 在实验中，用微波辅助法制备羟基磷灰石。从结果 可以看出： 当初始溶液pH值等于7时， 样品都为针棒状。 样品的长径比为3.04.0， 平均直径及长度分别为30 nm 和100

32、nm； 为纳米级别， 且分散度较好。 在包埋过程中， 用超声波分散在壳聚糖中，避免了羟基磷灰石的团聚。 在图6a中可以看到，微球的表面比较均匀，没有看到大 块的羟基磷灰石的团聚； 从图6b破裂成一半的微球中可 以看到复合微球表面较为圆整光滑，表面无块状物的团 聚，证明了羟基磷灰石纳米粉末已均匀分布在壳聚糖明胶网络中，符合仿生学原理。 3100 15 14 Mizushima Y, Ikoma T, Tanaka J, et al.Injectable porous hydroxyapatite microparticles as a new carrier for protein and li

33、pophilic drugs. J Control Release. 2006;110(2:260-265. Murugan R, Ramakrishna S. Production of ultra-fine bioresorbable carbonated hydroxyapatite. Acta Biomater. 2006;2(2:201-206. Itokawa H, Hiraide T, Moriya M, et al.A 12 month in vivo study on the response of bone to a hydroxyapatite-polymethylmet

34、hacrylate cranioplasty composite. Biomaterials. 2007;28(33:4922-4927. Wu TJ, Huang HH, Lan CW, et al.Studies on the microspheres comprised of reconstituted collagen and hydroxyapatite. Biomaterials. 2004;25(4:651-658. Tan KH, Chua CK, Leong KF,et al. Scaffold development using selective laser sinter

35、ing of polyetheretherketone-hydroxyapatite biocomposite blends. Biomaterials. 2003;24(18:3115-3123. Agnihotri SA, Mallikarjuna NN, Aminabhavi TM. Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery. J Control Release. 2004;100(1:5-28. Kasper FK, Kushibiki T, Kimura Y, et al.I

36、n vivo release of plasmid DNA from composites of oligo(poly(ethylene glycolfumarate and cationized gelatin microspheres. J Control Release. 2005;107(3: 547-561. Rodrigues CV, Serricella P, Linhares AB, et al.Characterization of a bovine collagen-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engin