水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

1、水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达龙锢，刘家云，刘莉，王宗仁【关键词】毕赤酵母SecretoryexpressionofhirudinsinPichiapastorisAbstractAIM:ToconstructhirudinexpressionvectorsandobtainitssecretoryexpressioninPichiapastoris(P.pastoris).METHODS:HirudinHV2andHV2N47KgeneswereamplifiedbyPCRandthecorrectgeneswerefusedtopPIC9afactorsignalandsubclonedin

2、topPIC9Ksecretoryexpressionvector.TheconstructsweretransformedintoP.pastorisstrainGSM1168,stablemulticopyintegrantswerescreenedonmediumcontainingincreasingconcentrationsofG418.Thenthescreenedoutcloneswereinducedbymethanoltoexpresshirudinproteins.ThesupernatantsofexpressionproductswereidentifiedbySDS

3、PAGEandWesternblotanalysis,anditsantithromboticactivitywasdeterminedtoo.RESULTS:Theexpressionvectorsweresuccessfullyconstructed,hirudinswereexpressedinsupernatantsofP.pastoris,andtheexpressionproductspossessedantithromboticactivity.CONCLUSION:HirudinscanbeexpressedsecretorilyinP.pastoris,whichoffers

4、abasisfornewdrugresearches.Keywordshirudin;Pichia;secretoryexpression【摘要】目的：构建水蛭素毕赤酵母表达载体，取得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达.方式：通过PCR扩增取得水蛭素HV2,HV2X47K基因，将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9a分泌信号下游，再亚克隆入高拷贝载体PPIC9K,构建表达质粒pPIC9KHV2,pPIC9KHV2X47K.重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性挑选高拷贝的稳固表达菌株，经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定.结果：成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体，取得水蛭素在毕赤酵母

5、中的分泌型表达，表达产物具有抗凝血酶活性.结论：水蛭素在毕赤酵母中取得分泌型表达，为研究新药奠定了基础.【关键词】水蛭素；毕赤酵母；分泌表达0引言水蛭素(hirudin)是从水蛭(Hirudomedicinalis)中分离出的抗凝血活性成份，是凝血酶的天然抑制剂1,具有高效的抗血栓形成作用和超级广漠的应用前景2-3.可是天然水蛭素来源匮乏,限制了其研究和临床应用，咱们以水蛭素HV2,HV2X47K的氨基酸序列为对象，通过PCR扩增取得了目的基因，克隆入毕赤酵母(PichiaPastoris)表达载体pPIC9K中，构建了水蛭素酵母分泌型表达载体，转化SMD1168毕赤酵母细胞并进行诱导表达，取

6、得了具有抗凝血酶活性的表达产物，为水蛭素的研究及临床应用奠定了基础.1材料和方式材料质粒pPIC9,pPIC9K,ToplOF菌株及毕赤酵母菌SMD1168由本实验室保留.TaKaRaTaq酶，限制性内切酶(EcoRI,Xhol,BamHI,Sall),T4DA连接酶均购自宝生物公司.发色底物ChromozymTH及ECL化学发光检测试剂盒购自Roche公司，鼠抗hirudin单抗(mAb)购自AntibodyShop公司，酵母基因组DA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司.电泳仪、电转仪均为BioRad公司产品.引物合成及DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成.方式水蛭素基因的获取依照水蛭素

7、HV2的氨基酸序列，依照文献4方式，采纳分段合成寡核甘酸片段，互补寡核甘酸片段的退火配对后，进行PCR扩增而取得HV2基因.HV2N47K是通过DNA改组和噬菌体亲和挑选取得的具有较高抗凝血酶活性的水蛭素变异体5,HV2N47K基因经PCR从pCANTAB5EHV2X47K载体中获取.用于PCR扩增的上游引物P1：5'CTCTCGAGAAMGAATTACTTAC3z,引入Xhol酶切位点，下游引物P2：5'GGGAATTCCTATTGTAAATATTC3',引入EcoRI位点.PCR扩增参数：94c变性45s,55退火45s,72延伸50s,共进行30个循环.扩增的PC

8、R产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定.酵母表达载体的构建将PCR产物用EcoRI和Xhol双酶切，回收目的片段，插入经相同酶切的PPIC9载体，转化宿主菌T0P10F,提取质粒，酶切鉴定含有全长HV1基因的重组子，并将其送上海生工生物工程公司测序.DNA测序正确后（命名为pPIC9HVl）,再经BamHI,Sall酶切后定向插入毕赤酵母表达载体PPIC9K,取得高拷贝表达载体PPIC9KHV2.酵母菌的转化及高拷贝整合菌株的挑选挑取GSM1168单菌落接种于10mLYPD中，30C振荡留宿，1%体积转接至100mLYPD中扩大培育至A600=；菌液于4,1000g离心5min,菌体依次用

9、50mL预冷的去离子水和10mL预冷的1mol/L山梨醇洗涤，最后将细胞重悬于mL预冷的山梨醇溶液中.Sall线性化的pPIC9KHVl及空载体pPIC9K各10Ug别离与100UL酵母细胞混匀，加入电转杯，冰浴5min,BioRad电转仪转化，电击终止后当即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，混匀.取mL转化物涂布于ID（g/LYNB,4X10-4g/LBiotin,20g/LDextrose,20g/L琼脂，1mol/L山梨醇）选择平板上，30培育24d,观看转化子的生长.再将MD平板上生长的阳性克隆依次转种至含1,2,3,4,5g/LG418的MD平板上，以在高浓度G418上正常生

10、长的菌落为高拷贝整合菌株.挑取高拷贝整合单菌落进行扩增，提取其基因组DNA,别离用P1和P2引物进行PCR扩增.表达菌株的培育及诱导表达取鉴定的单克隆菌株于2mLYPD中，30250r/min摇床培育过液，再以1%的量接种于10mLBMGY培育液（10g/L酵母提取物，20g/L蛋白豚，10g/L甘油，g/LYNB,mg/L生物素，L磷酸钾缓冲液）中，于30C,250r/min的摇床上培育至A600为48.离心搜集菌体,弃去BMGY培育基，改换为20mLBMMY培育液（10g/L酵母提取物，20g/L蛋白豚，mol/L磷酸钾缓冲液，g/LYNB,mg/L生物素，5mL/L甲醇）于30c诱导表达

11、，每24h加入甲醇（终浓度为50mL/L,V/V）并取样，离心搜集上清进行SDSPAGE鉴定.表达产物的分析表达菌株经诱导培育后，取表达上清进行15%的SDSPAGE电泳，用转印仪将蛋白转移到PVDF膜上，用封锁液37处置膜2h,漂洗后加人兔抗人酸性成纤维细胞生长因子的多克隆抗体于37c孵育1h.用PBS漂洗后，加入鼠抗hirudinmAb和HRP羊抗鼠IgG室温孵育1h,用ECL化学发光底物压片曝光，显影后观看结果.表达产物的活性检测取诱导表达的酵母上清液50HL,凝血酶50UL(60U/L)力口入至lj1mL反映缓冲液(50mmol/LTrisHClpH,mol/LNaCl)中,37保温5

12、小1.11,加入发色底物ChromozymTH,405nm波长下测定表达产物的活性，结果以每分钟A值的转变A405/min表示.2结果水蛭素基因的获取参照水蛭素HV2的氨基酸序列，分段合成的寡核甘酸片段磷酸化后，互补配对的碱基经退火形成双链DXA,经PCR扩增，取得约220bp的基因片段；同理，经PCR从pCANTAB5EHV2N47K载体中扩增，取得HV2N47K基因片段(图1).1: HV2基因PCR结果;2:HV2N47K基因PCR结果;3:pPIC9HV2；4:pPIC9HV2N47K；5:pPIC9；6:pPIC9KHV2；7:pPIC9KHV2N47K；8:pPIC9K；M:DL2

13、000DNA分子量标准；入:入HindHI酶切片断.图1目的基因的获取及表达载体的Xhol和EcoRI双酶切鉴定结果(略)酵母表达载体的构建及鉴定HV2,HV2N47K基因PCR扩增产物经EcoRI和Xhol双酶切，插入pPIC9载体，转化宿主菌T0P10F,提取质粒，DNA测序结果说明所取得的水蛭素基因与预期序列完全一致.序列正确的重组质粒命名为PPIC9HV2,pPIC9HV2X47K,后者经BamHI,Sall酶切后定向插入PPIC9K,取得高拷贝表达载体pPIC9KHy2,PPIC9KHV2N47K,经Xhol,EcoRI双酶切鉴定，取得约220bp的目的基因片段和被切成约kb的两个载

14、体片段（图1）,说明目的基因已正确克隆入表达载体中.的转化及高拷贝整合菌株的挑选Sall线性化的pPIC9KHV2,PPIC9KHV2N47K质粒转化GSM1168感受态细胞，在MDS平板上培育，取得His+转化菌落，将转化的His+菌落点种至含G418浓度为1,2,3,4,5g/L的MD平板上，随G418浓度的增加，GSM1168转化His+菌生长速度显现不同.取5g/LG418平板上生长的菌落增菌培育，提取酵母基因组DNA,进行PCR鉴定，结果以P1和P2引物所进行的PCR扩增均为阳性（图2）,提示水蛭素基因己成功整合到毕赤酵母染色体中.M:DL2000DNA分子量标准；1,8:SMD11

15、68；2"4:pPIC9KHV2整合克隆；57:pPIC9KHV2N47K整合克隆.图2PCR鉴定目的基因的整合（略）水蛭素的诱导表达重组有水蛭素基因的酵母菌株GSM1168经诱导表达后于培育基中可检出Mr约为7000的蛋白质，该蛋白在培育基中的含量随诱导时刻的延长而增多，在诱导表达120h后接近峰值.经Westernblot鉴定表达的蛋白能与鼠抗hirudinmAb结合，提示水蛭素在毕赤酵母菌SMD1168中取得分泌性表达（图3）.A:表达产物的SDSPAGE分析；B：表达产物的Westernblot鉴定.M:蛋白分子量标准；1:pPIC9HV2诱导72h培育上清；2:PPIC9H

16、V2未诱导培育上清；3:pPIC9HV2N47K诱导120h培育上清；4:pPIC9HV2诱导72h培育上清；5:pPIC9HV2N47K诱导120h培育上清.图3表达产物的SDSPAGE和Westernblot鉴定（略）表达产物的抗凝血酶活性分析酵母诱导表达产物采纳发色底物ChromozymTH测定其抗凝血酶活性，水蛭素HV2和HV2N47K表达上清的A405/min别离为，说明表达产物具有抗凝血酶活性，且HV2N47K的活性比HV2强.3讨论巴斯德毕赤酵母（P.Pastoris）是一种最近几年来普遍利用的真核基因表达系统，它具有表达效率高、遗传稳固性好、糖基化适中、表达产物可分泌和发酵工艺

17、成熟等许多优势，尤其是在分泌表达方面，由于自身细胞分泌的蛋白少，重组蛋白分泌量高，适合工业生产时的高密度发酵，有利于下游纯化.因此，毕赤酵母表达系统是最近几年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，己有多种外源蛋白在该宿主系统中取得了成功表达6.毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时，能利用甲醇作为惟一碳源，其甲醇利用的关键基因醇氧化酶基因(A0X1)的表达量可占细胞总mRNA的5%,该酶可占细胞总蛋白的30%以上，A0X1启动子受甲醇的严格诱导表达，被普遍用于驱动外源蛋白的高效表达，PPIC9,pPIC9K表达载体即采纳了A0X1高效表达启动子7.实验中咱们将水蛭素基

18、因插入PPIC9a分泌信号下游，利用A0X1高效启动子使目的基因能在酵母中高效分泌表达.在毕赤酵母表达系统中，外源基因是通过同源重组整合到宿主菌的染色体上的，因此构建的表达菌株稳固性很高.载体与酵母染色体的同源重组有两种方式：一是线性化载体与宿主染色体发生双互换，取代宿主染色体A0X1基因；另一种是经单互换插入宿主染色体的A0X1位点或His4位点.单互换转化效率比双互换高，且易患到多拷贝整合.一样来讲，整合的拷贝数越多，表达量越高8.咱们采纳Sall单酶切使表达载体线性化，表达框与宿主基因组发生单互换而整合于染色体中.由于PPIC9K载体带有卡那抗性基因，使阳性转化菌产生G418抗性，且整合

19、的拷贝数与G418抗性之间有必然的计量依托关系，通过提高G418浓度，容易挑选到高拷贝稳固整合菌株?实验结果说明，表达菌株即使在非选择性培育基中经120h诱导培育，仍能够有效地分泌具有生物学活性的目的蛋白.咱们通过PCR扩增取得了目的基因，成功构建了水蛭素HV2,HV2N47K毕赤酵母表达载体，经抗性挑选取得稳固整合菌株并进行诱导表达，取得了具有抗凝血酶活性的表达产物，为水蛭素的新药研究及临床应用奠定了基础.【参考文献】1 MarkwardtF.HirudinasalternativeanticoagulantahistoricalreviewJ.SeminThrombHemost,2002,28(5):405-414.2 SohnJH,KangHA,RaoKJ,etal.Currentstatusoftheanticoagulanthirudin:itsbiotechnologicalproductionandclinicalpracticeJ.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,57(56):606-613.3YavinYY,WolozinskyM,Cohen