临床检验基础

1、安徽理工大学医学院S c h o o lo fM e d i c i n e医学免疫学教案首页第 次课授课时间年 月 日教案完成时间年 月 日课程名称医学免疫学年级级专业、层次教师张荣波专业技术副教授授课方式学时2 学时职务大班（大、小）授课题目（章、节）第二十四章免疫诊断基本教材或主要参考书陈蔚峰主编医学免疫学（第四版，人民卫生出版社）教学目的和要求：掌握抗原抗体反应的原理，影响反应的因素，检测方法；掌握免疫细胞的检测方法大体内容与时间安排，教学方法：课堂讲授辅以启发式提问，配以多媒体投影1、抗原与抗体检测（1 学时）2、免疫细胞的测定（0.6 学时）3、免疫学检测方法的应用（0.4 学时）

2、教学重点、难点：重点：抗原抗体反应的原理、检测方法难点：血清学反应的原理、应用教研室审阅意见：_ （教学组长签名）_ （教研室主任签名）2004年 月 日1基本内容第一节抗原与抗体检测一、抗原与抗体反应的原理（一）原理高度特异性可逆性适当浓度和比例敏感性（二）影响抗原抗体反应的因素:1.电解质抗原抗体特异结合后，胶体粒便可发生脱水作用，此时易受电解质影响，如有适当浓度的电解质存在就会使它们失去部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝集或沉淀现象。故免疫学试验中多采用生理盐水稀释抗原或抗体。2.酸碱度 :pH 过高或过低都将直接影响抗原或抗体的理化性质，从而导致反应不发生或出现非特异性凝集，出现假

3、阳性或假阴性,合适的 pH 为 6-8。3.温度 :适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞机会。37 度通常是抗原体反应最适温度。此外适当震荡或搅拌也可促进抗原和抗体分子的接触，提高结合速度。二、抗原或抗体的检测方法（一）凝集反应 :颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体 , 在适当电解质存在的条件下 , 经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。1.直接凝集反应 : 指颗粒性抗原与相应抗体在电解质参与下直接结合所出现的凝集现象。2. 间接凝集反应 :将可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的载体上,使之成为致敏载体颗粒,然后与相应抗体或抗原作用, 在电解质参与下出现的凝集反应。常用载体：人的O 型红

4、细胞，绵羊红细胞，乳胶颗粒，活性炭颗粒等。（正向）间接凝集反应:已知抗原吸附于载体检测抗体。常见于测定病原微生物抗体、抗核抗体、抗甲状腺抗体等。 反向间接凝集反应: 用已知抗体检测抗原。常用于检测乙肝表面抗原（HBSsAg ）和甲胎蛋白（AFP ）等。间接凝集抑制反应 :即将可溶性抗原与相应抗体预先作用,然后再加入致敏颗粒（吸附相同可溶性抗原的乳胶颗粒）, 由于抗体已被可溶性抗原结合,因而致敏颗粒不发生凝集现象,称为间接凝集抑制试验。例如:乳胶妊娠诊断试验 ,检测尿液中绒毛膜促性腺激素,不凝集者为妊娠诊断试验阳性。（二）沉淀反应 :可溶性抗原（如细菌浸出液，组织浸出液和动物血清等）与相应抗体结

5、合后 ,在电解质存在条件下， 经过一定时间作用后，可出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。在作定量试验时,常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。1. 单向扩散试验 : 是一种定量试验，使抗原在含有抗体的琼脂介质中扩散,经一定时间后即可见抗原孔周围出现由抗原抗体复合物形的沉淀环。沉淀环的直径与抗原浓度成正比。故试验前应用已知不同浓度标准抗原制成标准曲线（纵座标为沉淀环直径，横座标为抗原浓度） ，可根据沉淀环直径的大小从标准曲线中查出待检样品中抗原的含量。（教案续页）辅助手段和时间分配1 学时图示图示图示2基本内容2. 双向扩散试验 :抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散，如抗原抗体相应且浓度比

6、例适当，则在抗原抗体之间可出现白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只能形成一条沉淀线；多种抗原体系统，测可表成多条沉淀线。由于抗原抗体相关性不同，其产生的沉淀线可有三种基本类型：1) 两种抗原的抗原决定簇完全相同， 它们与相应抗体作用后形成一条融合沉淀弧线。2) 两种抗原的抗原决定簇完全不同， 形成各自独立， 彼此交叉的两条沉淀线。3) 两种抗原的抗原决定簇部分相同，形成一条融合带交叉的沉淀线。3. 对流免疫电泳 :是一种将双向扩散和电泳技术相结合的检测方法。即在琼脂板上 , 使抗原和抗体在电场作用下定向移动 , 当抗原抗体相遇且二者浓度比例合适时 , 即可出现白色沉淀线。4.免疫电泳: 实验分二步

7、,先行电泳将抗原各成分依电泳速度不同分开,再进行双扩散 ,常用此法进行血清的蛋白种类分析,对于免疫球蛋减少或增多的疾病诊断或鉴别诊断有重要意义。（三）补体参与的反应:1.溶血反应此法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测,比凝集反应敏感。2.补体介导细胞毒试验: 细胞抗体补体 引起细胞膜穿孔,此时加入染料后 ,染料即可进入被穿孔的细胞 ,没有相应抗原的则不着色 ,此法常用于带各种抗原的细胞的检测、细胞表面抗原的鉴定 ,细胞及其亚群的计数及分离细胞。3.补体结合试验:这是一种有补体参与，并以绵羊细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。 参与本反应的五种成分可分为两个系统 :待检系统： 已知抗原（

8、或抗体）的待测抗体（或抗原） ；指示系统：绵羊红细胞和溶血素；此外还有补体。本反应常用来检测病人血清中的抗体，以诊断病毒性疾病和钩端螺旋体病等疾病，并可对分离的病毒和立克次体进行分型和鉴定。（四）用标记示踪进行抗原与抗体反应1.免疫荧光法 :原理 : 免疫荧光技术又称荧光抗体法。应用荧光素标记Ab 测定未知Ag ，通常在荧光显微镜下观察结果或用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM) 测定结果。荧光素 : 异硫氰酸荧光素(FITC)最大吸收光谱490-495 nm，最大发射光谱520-530 nm 呈黄绿色荧光; 巯基化藻红蛋白(PE) 最大吸收光谱490， 545，565 nm，

9、最大发射光谱580 nm 呈橙红色荧光。2. 酶免疫测定法 (enzyme immunoassay，EIA): 酶免疫技术是通过适当的酶促化学反应和免疫反应，使抗体（或抗原）与酶蛋白分子结合，形成酶标抗体（或抗原） , 该结合物保留免疫学活性的酶活性 , 因而既有抗原抗体反应特异性 , 又有酶促反应的特异性。酶分解底物后的显色深浅可反映标本中抗原或抗体的含量。常用酶：辣根过氧物酶、碱性磷酸酶。常用方法: 酶联免疫吸附试验 ELISA（教案续页）辅助手段和时间分配图示图示图示图示图示3基本内容3. 放射免疫测定法（radioimmunoassay, RIA ） :原理 : 放射性同位素(131I

10、, 或125I) 标记 Ag 或 Ab 测定 Ab 或 Ag, 通过测定放射活性判断结果。该法常用于测定微量物质 : 如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及 lgE 等4化学发光免疫分析法5. 免疫印迹法 （ Western blot ）该法又称 Western 印迹法 :它将凝胶电泳与固相免疫结合，将通过电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。6免疫 PCR：将免疫的特异性和PCR 的敏感性相结合的一种免疫学检测技术，特别适用于体液中含量甚微的抗原和抗体的检测。第二节免疫细胞的测定一、淋巴细胞的分离:1. 密度梯度离心法 : 用淋巴细

11、胞分层液 (聚蔗糖 Ficoll- 泛影葡胺 Hypague) 比重 1.077+/-0.001; 除去红细胞，粒细胞,所获细胞称外周血单个核细胞(PBMC)其中淋巴细胞>90%。2.流式细胞仪flow cytometer ， fluorescent activated cell sorter,FACS3.磁珠分离法: 抗细胞表面分子的抗体包被磁珠(直径 <1.5 m)，加入细胞悬液孵育一定时间后，将混合物置磁场中借磁场引力使磁珠结合细胞与非结合细胞分开。在一定条件下，再将所需细胞与磁珠解离。二、白细胞的功能测定(一 ) T 细胞功能测定 :常用 T 细胞增殖试验 ; 其原理是 :

12、 T 细胞表面含有有丝分裂原受体 ,能接受植物血凝素（ PHA ）、刀豆蛋白 A （ CanA ）和美州商陆（PWM ）等有丝分裂原的刺激，转化成为淋巴母细胞。1. 3H-TdR掺入法 :在淋巴细胞接受有丝分裂素刺激发生转化过程中,将氚胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ）加入培养液中 ,3H-TdR 被作为合成 DNA 的原料摄入细胞内。通过测定细胞内放射性物质的相对活性 （以脉冲数 /分 ,即 CPM 表示）,就能较客观的反映淋巴细胞对刺激物的应答水平。2. MTT 法 :MTT 是一种甲氮唑盐可作为线粒体脱氢酶的底物，MTT 经线粒体脱氢酶作用，分解产生兰黑色物质，该产物的多少与活细胞数呈正相

13、关，用酶标仪测光密度 (595nm) 判断结果。3细胞毒试验 :CTL 、 NK 细胞对靶细胞均有直接杀伤作用 ,可根据待检效应细胞的性质 , 选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等。该试验可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方法的研究。（二） B 细胞功能测定：1、 B 细胞增殖试验2、抗体形成细胞测定（三）吞噬细胞功能测定1、 趋化功能测定2、 吞噬功能测定（教案续页）辅助手段和时间分配0.6 学时图示图示4基本内容第三节免疫学检测方法的应用一、免疫学检测方法的评估与选择特异性真阴性 /（真阴性假阳性）× 100敏感性真阳性 /（真阳性假阴性）× 100二、疾

14、病诊断1 感染性疾病2 免疫缺陷病3 自身免疫病4 超敏反应性疾病5 肿瘤三、免疫学监测1、监测感染性疾病:乙肝、 AIDS 等2、监测肿瘤3、监测移植排斥反应等（教案续页）辅助手段和时间分配04 学时5（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配6（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配7小结复习思考题，作 业 题情况反映及分析（教案末页）抗原与抗体特异性结合的原理，是建立许多免疫学检测方法的基础。免疫标记技术大大提高了检测Ag/Ab 的敏感性，既能定性也能定量。细胞生物学，分子生物学等相关学科新技术的应用，又建立了许多研究免疫细胞功能的新方法，从而极大地推动免疫学及相关学科的发展。1.可以用哪些方法定量检测血液标本中的抗原？2.可