蛋白质与酶工程第二章微生物发酵产酶

1、Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物发酵产酶酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPla

2、nt cell cultureAnimal cell cultureFew exampleContents of chapter 21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物3、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生物合成的模式GoGoGoGo5、动植物细胞培养产酶，自学2.1 酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法则- Central Dogma 2、RNA的生物合成- Transcription3、蛋白质的生物合成- Translation4、酶生物合成的调节- RegulationGoGoGoGo下一节下一节本章目录Reverse transcr

3、iption1、中心法则-Central Dogma nReplication Replication 复制复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。nTranscription Transcription 转录转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。nTranslation Translation 翻译翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。nReverse translation Reverse translation 逆转录逆转录：以RNA

4、为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。本节目录2、RNA的生物合成(转录)- Transcription细胞内RNA的生物功能(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。 (2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4) 各种小

5、分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点1 1、转录的不对称性转录的不对称性：在：在RNARNA的合成中，的合成中，DNADNA的二条链中仅有的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链反义链 antisense strandantisense strand（无意义链，负链）：（无意义链，负链）：在在RNARNA的转录中，的转录中，用作模板的用作模板的DNADNA链称为反义链。链称为反义链。有义链有义链 coding strandcoding strand（编码链，正链）：（编码链，正链）：在在RNARNA的

6、转录中，不的转录中，不作为模板的作为模板的DNADNA链称为有义链。链称为有义链。2 2、转录所需酶：、转录所需酶：依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶又称为转录酶，是以又称为转录酶，是以DNADNA为模板的一类为模板的一类RNARNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1 1种种RNARNA聚合酶催化所有聚合酶催化所有RNARNA的生物合成。而在真核生物中的生物合成。而在真核生物中RNARNA聚合酶有聚合酶有3 3种种，分别为，分别为RNARNA聚合酶聚合酶、RNA

7、RNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚合酶聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4 41010个，亚基种类有个，亚基种类有4 46 6种。种。 转录过程n起始位点的识别起始位点的识别 recognitionrecognitionn转录起始转录起始 initiationinitiationn链的延伸链的延伸 elongationelongationn转录终止转录终止 terminationterminationn转录后加工转录后加工 modificationmodificationThe E. coli RNA polymerase holoenzyme con

8、sists ofsix subunits: Possible catalytic subunitsPromoterspecificity本节目录3、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译翻译: : 以以mRNAmRNA为模板，以各种氨基酸为底物，为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖体上通过各种在核糖体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅因子的作用，、酶和辅因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译合成多肽链的过程，称为翻译mRNAmRNA蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）蛋白质合成的几个要素-

9、mRNA(模板，template)nmRNAmRNA是带有是带有DNADNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。n以以mRNAmRNA为模板为模板, ,合成一定结构的多肽链的过程合成一定结构的多肽链的过程( (翻译翻译) )，就，就是将是将mRNAmRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。的氨基酸排列顺序。蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codonnmRNAmRNA分子中分子中, ,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基

10、酸或其它信息，称为氨基酸或其它信息，称为密码子密码子或或三联密码三联密码。n四种核苷酸编成三联体可形成四种核苷酸编成三联体可形成4 43 3个即个即6464个密码子。其中：个密码子。其中：n一个起始密码一个起始密码: : AUGAUGn三个终止密码三个终止密码: : UAA UGA UAGUAA UGA UAGn多数氨基酸拥有多数氨基酸拥有 2-42-4个密码个密码 遗传密码的性质遗传密码的性质1 密码的连续性密码的连续性 起始密码子决定所有后续密码子的位置。起始密码子决定所有后续密码子的位置。2 2 密码的简并性密码的简并性 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为由一种以上密码子编码同一

11、个氨基酸的现象称为简并简并，对应于同一种氨基酸的几个密码子称为对应于同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子同义密码子。同义密码子第一、同义密码子第一、第二位核苷酸往往第二位核苷酸往往是相同的，而第三是相同的，而第三位核苷酸的改变不位核苷酸的改变不一定影响所编码的一定影响所编码的氨基酸。氨基酸。一般说来，编码某一般说来，编码某一氨基酸的密码子一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频蛋白质中出现的频率也越高（精氨酸率也越高（精氨酸Arg是个例外）。是个例外）。2.3 密码的普遍性与特殊性密码的普遍性与特殊性 密码子表是具有普遍性的，适用于一切生物，但也密码子表是具有普遍性的

12、，适用于一切生物，但也有些特殊情况。有些特殊情况。蛋白质合成的几个要素- 转运RNA (transporter)ntRNAtRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。ntRNAtRNA有特异性，至少有有特异性，至少有2020种以上。每种种以上。每种tRNAtRNA的反密码环顶端的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的均有由三个核苷酸组成的反密码反密码，能与，能与mRNAmRNA上相应的密码互上相应的密码互补结合。补结合。酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密码反密码mRNA密码密码(codon)(codo

13、n)与反密码与反密码(anticodon)(anticodon)的碱基配对的碱基配对蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosomen核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。核核蛋蛋白白体体的的组组成成蛋白质的合成过程n肽链合成的起始肽链合成的起始 initiationn肽链合成的延伸肽链合成的延伸 elongationn肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放 termination and releasen合成多肽的输送和加工合成多肽的输送和加工 transport and modificationn蛋白质分子的折叠蛋白质分子的折叠 folding氨基酸

14、活化生成氨酰-tRNA 氨基酸活化氨基酸活化氨基酸是生物合成蛋白质的原料，氨基酸在氨基酸是生物合成蛋白质的原料，氨基酸在氨酰氨酰-tRNA合成酶合成酶的作用下生成活化氨基酸的作用下生成活化氨基酸AA-tRNA才能被准确地运送到才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤关键步骤，只有，只有tRNA携带了正确的氨基酸，多肽合成的准确性才有保障。携带了正确的氨基酸，多肽合成的准确性才有保障。原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP和起始因子（Initiation Factor）

15、的参与下，核糖体30 S亚基，fMet- tRNAF ，mRNA和50 S 亚基结合，组成起始复合物的过程。主要包括5个步骤：（1）30 S亚基与起始因子IF3 结合；（2）30 S亚基与mRNA结合，形成30 S-IF3-mRNA复合物；（3）fMet- tRNAF 与起始因子IF2以及GTP结合，生成fMet- tRNAF -IF2-GTP；（4）在起始因子IF1的参与下，fMet- tRNAF-IF2-GTP与30 S-IF3-mRNA结合生成30 S起始复合物。在此30 S起始复合物中，fMet- tRNAF上的反密码子正好与mRNA上的起始密码子AUG结合；（5）50 S亚基与上述3

16、0 S起始复合物结合，形成完整的70 S核糖体。同时放出IF1，IF2，IF3 ，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70 S核糖体形成时，fMet- tRNAF 位于70 S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。 蛋白质合成起始IF-3IF-1A U G53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi进进位位转转位位成肽成肽延伸Tu TsGTPGDPA U G53TuTsGTP分子生物学 Molecular Biology第三章生物信息的传递（上）-从mRNA 到蛋白质分子生物学 Molecular Biology第三章第三章生物信息的传递（上）生物信息的传递（上）-从

17、从m mRNA RNA 到到蛋白质蛋白质fMetA U G53fMetTuGTP合成终止1.1.出现终止密码出现终止密码并与终止因子结并与终止因子结合合; ;2.2.肽键水解肽键水解, ,多肽多肽释放释放; ;3.3.tRNA,mRNAtRNA,mRNA, ,大小大小亚基解离亚基解离. . 分子生物学 Molecular Biology第三章生物信息的传递（上）-从mRNA 到蛋白质U A G53COO-高效率的蛋白质合成体系蛋白质前体的加工蛋白质前体的加工 新生多肽链大多数是没有功能的，必须经过加新生多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。工修饰才能转变为有活性的

18、蛋白质。N端端fMet或或Met的切除的切除二硫键的形成二硫键的形成特定氨基酸的修饰。氨基酸侧链的修饰包括：特定氨基酸的修饰。氨基酸侧链的修饰包括： 磷酸化（如核糖体蛋白质）、磷酸化（如核糖体蛋白质）、 糖基化（如各种糖蛋白）糖基化（如各种糖蛋白） 、 甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质） 、 乙基化（如组蛋白）乙基化（如组蛋白） 、 羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等。羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等。切除新生链中非功能片段切除新生链中非功能片段肽链的折叠肽链的折叠n蛋白质的空间结构如何形成？n功能与结构如何统一？n体外、体内的结构如何变化？n蛋白质分子设计及蛋白质工程的需

19、要蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要n越来越多的基因工程产物需要复性复活越来越多的基因工程产物需要复性复活, , 要求蛋白质折叠要求蛋白质折叠的理论及技术的指导的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形成正确的折叠才能表现出功能和活性。蛋白质的折叠本节目录4 4、酶生物合成的调节、酶生物合成的调节 按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：组成型酶组成型酶恒定（速度、浓度）恒定（速度、浓度）适应型酶适应型酶 其在细胞中的合成速度和浓其在细胞中的合成速度和浓 度受到细胞所处环境因素的影度受到细胞所处环境因素的影响响, ,变化很大。变化很大。(

20、(调节型酶调节型酶) )为什么环境发生变化，为什么环境发生变化，酶合成的量也随之改变酶合成的量也随之改变？适应型酶的合成在细胞内受到的调控包括适应型酶的合成在细胞内受到的调控包括: :n转录水平的调控转录水平的调控n转录产物的加工调节转录产物的加工调节n翻译水平的调控翻译水平的调控n翻译产物的加工调节翻译产物的加工调节n酶降解的调节酶降解的调节DNARNA原核生物中酶生物合成调节机制原核生物中酶生物合成调节机制原核生物中酶生物合成的调节主要是原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节转录水平的调节( (又称为又称为 基因水平调节基因水平调节) )19601960年年,Jocob&M

21、onod ,Jocob&Monod 提出提出操纵子学说操纵子学说n操纵子（操纵子（operonoperon）：是一组功能上相关，受）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。 调节基因调节基因(regulator gene)(regulator gene)： 可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein) ，通过与效应物通过与效应物(effector) （包括诱导物或辅阻遏物）（包括诱导物或辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵

22、基因的结合力。因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。RPOSD N AC RP-cA M P复 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP复合物的作用示意图 启动基因启动基因（promotor gene）（）（启动子）：启动子）： 有两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），），又称环腺苷酸受体蛋白又称环腺苷酸受体蛋白(cA

23、MP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。 操纵基因操纵基因（Operater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因结构基因（Structural gene）: : 决

24、定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。酶合成的调节机制酶合成的调节机制 酶合成的诱导酶合成的诱导 末端产物阻遏末端产物阻遏 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 1. 1. 酶合成的诱导酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象：乳糖操纵子模型酶合成诱导的现象：乳糖操纵子模型 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰

25、酶。透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1 1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；上述三种酶合成；（2 2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；酶合成； 表明菌体生物合成的经济原则：表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳

26、糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性） 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1 1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2

27、 2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体生长的经济原则: :不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻

28、遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻

29、挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物调控方式调控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 与操纵基与操纵基因结合因结合阻遏效应阻遏效应举例举例酶的诱导酶的诱导有活性有活性不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译诱导物诱导物转录，转录，继而翻译继而翻译乳糖操乳糖操

30、纵子纵子酶的阻遏酶的阻遏无活性无活性阻遏物阻遏物不转录，不转录，继而不翻译继而不翻译色氨酸色氨酸操纵子操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。慢的底物的有关酶合成的现象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或

31、氮源等）在其分解过程中所产生的碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象二次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。 这一现象又称葡萄糖效应，产这一现

32、象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）, ,亦称亦称降解物基因降解物基因活化蛋白（活化蛋白（CAPCAP）。）。真真核核生生物物酶酶生生物物合合成成的的调调节节细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成基因扩增加速酶的生物合成基因扩增加速酶的生物合成增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成2.2 常见产酶微生物产酶细胞的简介 酶发酵生产的细胞必需具备如下条件1 酶的

33、产量高；2 产酶稳定性好；3 容易培养和管理；发酵周期短，营养需求简单；4 产物杂质少，利于酶的分离纯化;5 安全可靠，非致病性. 不同类型、植物、动物细胞的特性比较不同类型、植物、动物细胞的特性比较n 动植物细胞培养缺点n动植物细胞体积大、对剪切力敏感，要求特殊生物反应器。n动植物细胞生长速率、代谢速率低，发酵周期长，对防止杂菌污染的技术要求高。n动物细胞营养要求苛刻.n利用微生物产酶的优点n1、种类多，酶种丰富，易筛选突变株n2、生长周期短n3、培养基便宜，条件简单n4、基因工程常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production基本要求：n不

34、是致病菌n发酵周期短,产酶量高n不易变异退化n最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。n对医药和食品用酶,还应考虑安全性：n凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!n由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。n非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。下一节下一节本章目录常用的微生物常用的微生物细菌细菌放线菌放线菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌（一）细菌（一）细菌 工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter)

35、棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌短杆菌(Brevibacterium) 用于生产：用于生产： 生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) （1）大肠杆菌短杆菌短杆菌长杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌细胞壁的结构细胞壁的结构（ G+G+细菌与细菌与G G细菌细胞壁构造的比较）细菌细胞壁构造的比较）革兰氏阳性细菌（革兰氏阳性细菌（G+G+）革兰氏阳性细菌（革兰氏阳性细菌（G-G-）肽

36、聚糖肽聚糖肽聚糖肽聚糖外膜外膜革兰氏染色：菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（革兰氏染色：菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G G+ +） 菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-G-）阴性阴性阳性阳性有的呈杆状，有的近似球状；有的呈杆状，有的近似球状；革兰氏染色阴性，无芽孢，革兰氏染色阴性，无芽孢，无荚膜，运动或不运动无荚膜，运动或不运动菌落从白色到黄白色，菌落从白色到黄白色，光滑闪亮，扩展光滑闪亮，扩展革兰氏阴性菌大肠杆菌大肠杆菌扫描电镜图（分裂）带有纤毛的大肠杆菌 大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。病的，

37、会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。长迅速，而且营养要求低。 应用：应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖；繁殖； 大肠杆菌也是最早用作大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；基因工程的宿主菌； 工业上生产工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。 大肠杆菌可以用于大肠杆菌可以用于生产多种酶。生产多种酶。 大肠杆菌产生的酶一大肠杆菌产生的酶一般都属于般都属于胞内酶胞内

38、酶，需要经，需要经过细胞破碎才能分离得到过细胞破碎才能分离得到。 例如，大肠杆菌谷氨例如，大肠杆菌谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或用于生产酸含量或用于生产-氨氨基丁酸；基丁酸； 大肠杆菌天冬氨酸酶，用于催化延胡索酸大肠杆菌天冬氨酸酶，用于催化延胡索酸加氨生产加氨生产L L天冬氨酸；天冬氨酸； 大肠杆菌青霉素酰化酶，用于生产新的半合大肠杆菌青霉素酰化酶，用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素；成青霉素或头孢霉素； 大肠杆菌天冬酰胺酶，对白血病具有显著疗大肠杆菌天冬酰胺酶，对白血病具有显著疗效；效； 大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶，用于分解乳糖或半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其他其他

39、-半乳糖苷。半乳糖苷。 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、核酸外切酶等，在基因连接酶、核酸外切酶等，在基因工程等方面广泛应用。工程等方面广泛应用。（2）枯草杆菌芽孢杆菌属，细胞呈杆状；芽孢杆菌属，细胞呈杆状；革兰氏染色阳性，无荚膜，革兰氏染色阳性，无荚膜，运动运动菌落粗糙，不透明，扩张，菌落粗糙，不透明，扩张，不闪光，污白色或微带黄色不闪光，污白色或微带黄色产酶种类：产酶种类：应用最广泛的产酶微生物，应用最广泛的产酶微生物，- -淀粉酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、碱性磷酸酶、果胶酶、碱性磷酸酶、- -葡

40、聚糖酶、葡聚糖酶、5 5- -核苷酸酶核苷酸酶芽孢芽孢芽孢芽孢 ： 某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的休眠体。环境有较强抵抗力的休眠体。荚膜：荚膜：某些细菌细胞壁外某些细菌细胞壁外的一层粘液性物质。的一层粘液性物质。周生鞭毛枯草杆菌（二）放线菌具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌。链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，革兰氏染

41、色阳性。菌丝有菌丝体，革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链链链霉菌是产生葡萄糖异构酶的主要链霉菌是产生葡萄糖异构酶的主要微生物，还可产纤维素酶、碱性蛋微生物，还可产纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶、谷白酶、中性蛋白酶、几丁质酶、谷氨酰胺转氨酶等氨酰胺转氨酶等放线菌的形态放线菌的形态（三）霉菌霉菌是一类丝状真菌。用于产酶的霉菌主要有霉菌是一类丝状真菌。用于产酶的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲酶、青霉、木霉、根霉、黑曲霉、米曲霉、红曲酶、青霉、木霉、根霉、毛霉毛霉（1 1）黑曲霉）

42、黑曲霉黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横膈的分黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横膈的分支菌丝构成，均从黑褐色顶囊大球形，小梗双层，分生支菌丝构成，均从黑褐色顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙孢子球形，平滑或粗糙黑曲霉可用于产生许多酶，如糖化酶、黑曲霉可用于产生许多酶，如糖化酶、- -淀粉酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等曲霉曲霉葡萄黑曲霉腐烂病葡萄黑曲霉腐烂病黑曲霉黑曲霉（可引起烧伤病人皮肤感染或真菌性肺部感染）（2）米曲霉米曲霉是曲霉属

43、黄曲霉群霉菌。菌群一般为黄绿色，后米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌群一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶型，变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶型，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达生孢子梗长达2mm2mm左右，粗糙。左右，粗糙。米曲霉中的糖化酶和蛋白酶的活力较强，因此米曲霉米曲霉中的糖化酶和蛋白酶的活力较强，因此米曲霉在我国传统的酒曲、酱油曲的制造中广泛应用。此外，在我国传统的酒曲、酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还产氨酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶米曲霉还产氨酰化酶、磷酸二酯酶、

44、果胶酶、核酸酶P P等等米曲霉 ( (3 3) ). .红曲霉红曲霉 红曲霉（红曲霉（MonascusMonascus）菌落初期白色，老熟后）菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色，通常形成红色色变为淡粉色、紫红色或灰黑色，通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分支甚繁。分生孢子素。菌丝具有隔膜，多核，分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支的顶端，单生或成链，闭囊着生在菌丝及其分支的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄、其内散生壳球形，有柄、其内散生1010多个子囊，子囊球形多个子囊，子囊球形，内含，内含8 8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊

45、壳内。留在闭囊壳内。 红曲霉可用于生产红曲霉可用于生产-淀粉酶、糖化酶、麦芽淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。糖酶、蛋白酶等。 红曲霉（4）青霉青霉属半知菌纲。营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明青霉属半知菌纲。营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横膈，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，的颜色，有横膈，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分支，小梗顶端串生分生孢子，分生孢顶端形成帚状分支，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，

46、其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数军中产生菌核囊和子囊孢子，亦有少数军中产生菌核青霉菌形态青霉菌形态青霉菌落青霉菌落青霉中可用于产葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶青霉中可用于产葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶凝乳蛋白酶、核酸酶等。凝乳蛋白酶、核酸酶等。青 霉青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子柑桔青霉为害（5）木霉木霉属半知菌纲。菌落生长迅速，呈棉絮状或致密从束木霉属半知菌纲。菌落生长迅速，呈棉絮状或致密从束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或

47、单生，分生孢子由小梗相继生出，靠黏液把它们聚集成球形或近生孢子由小梗相继生出，靠黏液把它们聚集成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形，光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。卵形，光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。木霉是生产纤维素酶的主要菌株。木霉生产的纤维素酶木霉是生产纤维素酶的主要菌株。木霉生产的纤维素酶包含包含C1C1酶、酶、CxCx酶和纤维二糖酶。酶和纤维二糖酶。木霉菌形态木霉菌形态木霉菌落木霉菌落（6）根霉根霉生长时，由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出根霉生长时，由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生

48、出成群的孢子囊梗，梗的顶假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。孢子呈球形、端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。孢子呈球形、卵形或不规则形状卵形或不规则形状根霉可用于生产糖化酶、根霉可用于生产糖化酶、- -淀粉酶、蔗糖酶、淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶。纤维素酶、半纤维素酶。根霉菌形态根霉菌形态根霉菌落根霉菌落根霉孢子根霉孢子囊囊根 霉甜瓜根霉果腐病菜豆根霉软腐病葡萄根霉腐烂病（7）毛霉毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延

49、，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般单生，分支较少或不分支。孢子囊梗顶般单生，分支较少或不分支。孢子囊梗顶端都有膨大成球状的孢子囊。端都有膨大成球状的孢子囊。毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶、果胶酶、凝乳酶、- -淀粉酶淀粉酶毛霉菌形态毛霉菌形态毛霉菌落毛霉菌落（四）酵母（1 1）啤酒酵母）啤酒酵母啤酒工业中广泛应用的酵母。细胞有圆形、卵形、啤酒工业中广泛应用的酵母。细胞有圆形、卵形、椭圆形或腊肠形。在麦芽汁培养基上菌落为白色，椭圆形或腊肠形。在麦芽汁培养基上菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。有

50、光泽，平滑，边缘整齐。酵母形态酵母形态啤酒酵母除了用于啤酒、酒类的生产外，还用于啤酒酵母除了用于啤酒、酒类的生产外，还用于生产转换酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产生产转换酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产酵母菌落酵母菌落（2 2）假丝酵母）假丝酵母假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子。在麦芽汁琼脂培养基上，子囊孢子、冬孢子。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。菌落呈乳白色或奶油色。假丝酵母主要用于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶以及脱氢酶等。假丝酵母主要用

51、于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶以及脱氢酶等。啤酒酵母啤酒酵母（正在裂殖）啤酒酵母粉假丝酵母假丝酵母小 结 产酶微生物的特点产酶微生物的特点 1、种类多，酶种丰富，易筛选突变株 2、生长周期短 3、培养基便宜，条件简单 4、基因工程2.3 酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production一、培养基二、发酵条件及控制- Transcription三、提高产酶的措施- TranslationGoGoGo下一节下一节本章目录五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因

52、子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（培养基（mediummedium）是人工配制的，用于细胞培养和发酵）是人工配制的，用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。的各种营养物质的混合物。一、培养基各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求l 构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架l 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量l 所有酶的重要组成部分所有酶的重要组成部分 常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物质及其降解物异

53、养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制构成细胞物质和代谢产物中氮素构成细胞物质和代谢产物中氮素氮源有机氮源无机氮源氮源氮源 有机

54、氮源主要是各种蛋白质及其水解产物，例如，酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸等。 无机氮源是各种含氮的无机化合物，如氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐和硝酸盐等。 n 不同的细胞对氮源有不同的要求，应当根不同的细胞对氮源有不同的要求，应当根据细胞的营养要求进行选择和配置。据细胞的营养要求进行选择和配置。n 一般说来，一般说来，n 动物细胞动物细胞要求有机氮源；要求有机氮源；n 植物细胞植物细胞主要使用无机氮源；主要使用无机氮源；n 微生物细胞微生物细胞中，中，异养型细胞异养型细胞要求有机氮源要求有机氮源，自养型细胞自养型细胞可以采用无机氮源

55、。可以采用无机氮源。在使用无机氮源时，在使用无机氮源时，铵盐和硝酸盐的比例铵盐和硝酸盐的比例对细胞对细胞的生长和新陈代谢有显著的影响，在使用时应充的生长和新陈代谢有显著的影响，在使用时应充分注意。分注意。注意注意碳氮比（碳氮比（C/NC/N）对酶的产量有显著影响。对酶的产量有显著影响。碳氮比（碳氮比（C/NC/N）是指培养基中碳元素的总量与氮元是指培养基中碳元素的总量与氮元素总量之比。素总量之比。有时也采用培养基中所含的碳源总量和氮源总量之有时也采用培养基中所含的碳源总量和氮源总量之比来表示碳氮比。比来表示碳氮比。n无机盐无机盐n无机盐的作用无机盐的作用n 无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所

56、无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pHpH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。 n 无机元素是通过在培养基中添加无机盐无机元素是通过在培养基中添加无机盐来提供的，一般采用添加水溶性的硫酸盐、磷来提供的，一般采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等。酸盐、盐酸盐或硝酸盐等。n 有些微量元素在配制培养基所使用的水有些微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量，不必再添加。中已经足量，不必再添加。n 不同的无机元素在细胞的生命活动中作用有不同的无机元素在细胞的生命活动中作用有所不同

57、。所不同。n 有些是细胞的主要组成元素，如磷、硫等；有些是细胞的主要组成元素，如磷、硫等；n 有些是酶分子的组成元素，如磷、硫、锌、有些是酶分子的组成元素，如磷、硫、锌、钙等；钙等；n 有些作为酶的激活剂调节酶的活性，如钾、有些作为酶的激活剂调节酶的活性，如钾、镁、锌、铜、铁、锰、钙、钼、钴、氯、溴、碘镁、锌、铜、铁、锰、钙、钼、钴、氯、溴、碘等；等；n 有些则对有些则对pHpH值、氧化还原电位、渗透压起调值、氧化还原电位、渗透压起调节作用，如钠、钾、钙、磷、氯等。节作用，如钠、钾、钙、磷、氯等。 n 在微生物的发酵生产中，有些金属离子是在微生物的发酵生产中，有些金属离子是酶的组成成分，如酶的

58、组成成分，如钙离子钙离子是淀粉酶的成分之一是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。，也是芽孢形成所必需的。n 无机盐一般在无机盐一般在低浓度低浓度情况下有利于酶产量情况下有利于酶产量的提高，而的提高，而高浓度高浓度则容易产生抑制。则容易产生抑制。n 根据细胞对无机元素需要量的不同，无根据细胞对无机元素需要量的不同，无机元素可以分为大量元素和微量元素两大类：机元素可以分为大量元素和微量元素两大类：大量元素大量元素：P、S、K、Na、Ca、Mg、ClP在细胞增殖分化时大量需要，主要由磷在细胞增殖分化时大量需要，主要由磷酸二氢钠、磷酸二氢钾供应。酸二氢钠、磷酸二氢钾供应。 P参与核酸、参与核酸、能

59、量代谢。能量代谢。K直接影响培养物中酶的活性。直接影响培养物中酶的活性。Ca的来源主要是氯化钙、硝酸钙。的来源主要是氯化钙、硝酸钙。硫酸镁作为硫酸镁作为S和和Mg的来源。的来源。微量元素微量元素：Cu 、 Mn 、Zn 、Mo 、Co 、Br 、I等等n 微量元素是指细胞生命活动必不可少，但微量元素是指细胞生命活动必不可少，但是需要量微小的元素。是需要量微小的元素。n 微量元素的需要量很少，过量反而对细胞微量元素的需要量很少，过量反而对细胞的生命活动有不良影响，必须严加控制。的生命活动有不良影响，必须严加控制。 生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不

60、能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子种生长因子 n1、选择适宜的营养物质n2、