氯沙坦干预病毒性心肌炎恢复期、慢性期心脏胶原表达及心功能的实

1、    氯沙坦干预病毒性心肌炎恢复期、慢性期 心脏胶原表达及心功能的实验研究        【摘要】目的观察病毒性心肌炎恢复期、慢性期心脏间质胶原表达及其对心功能的影响，并初步探讨药物干预的效果，为临床干预心肌纤维化提供实验依据。方法建立恢复期、慢性期病毒性心肌炎小鼠模型，通过阻抗微分法观察心排血量，H.E.染色及苦味酸天狼猩红胶原特异染色偏振光显像进行心脏间质胶原的组织化学观察，RT-PCR观察心脏I型胶原mRNA表达的变化，并与氯沙坦(losartan)干预后比

2、较。结果病毒性心肌炎恢复期心脏胶原增生，心排血量降低，氯沙坦干预后胶原表达无论从蛋白水平还是从mRNA水平均明显降低，但心排血量未见明显改善；病毒性心肌炎慢性期心脏胶原大量增生，心排血量降低，氯沙坦干预后胶原表达无论从蛋白水平还是从mRNA水平均明显降低，心排血量改善，与正常对照组比较差异无显著性。结论病毒性心肌炎恢复期可能存在修复性纤维化和反应性纤维化两种胶原增生状态，二者对心功能的影响不同，这可能是氯沙坦消除增生的胶原后心脏功能不见明显改善的原因。病毒性心肌炎慢性期胶原蛋白增生为单纯性反应性纤维化，使心排血量下降，氯沙坦部分阻逆反应性增生胶原，可提高心排血量，改善心脏功能。【关键词】氯沙坦

3、心肌炎胶原心脏功能试验 Expression of myocardial collagen and cardiac function in recovery and chronic stage of viral myocarditis: Losartan intervention study JING Zhicheng*, CHENG Xiansheng, YANG Yingzhen. *Division of Cardio-pulmonary Circulation, Fu Wai Hospital, PUMC & CAMS, Beijing 100037【Abstract】Obje

4、ctiveTo investigate the remodeling of myocardial interstitial collagen in mice with viral myocarditis (VMC) at revovery and chronic stage and its effects of cardiac function, preliminarily probe the feasibility of drug intervention, offer the experimental evidence for clinic to intervene the fibrosi

5、s of heart interstitium.MethodsThe mice model with VMC was established. CO was measured by impedance differential plethysmography, myocardial interstitial collagen was observed by staining with H.E. and Sirius Red in a supersaturated picric acid solution viewed by polarization microscopy. The change

6、s of mRNA expression of collagen type I were analyzed by RT-PCR. The results were compared with those after intervention with Losartan.ResultsMyocardial collagen proliferated significantly and CO decreaed in two stages of VMC, and the expression of collagen mRNA and protein decreased remarkably afte

7、r intervention with Losartan. In chronic stage, CO was improved after intervention with Losartan and there was no significant difference compared with normal control, but after intervention in recovery stage, CO was no significant difference compared with VMC that without intervening markably, CO im

8、proved. ConclusionAt recovery stage, there could be two kinds of fibrosis course: reparative fibrosis and reactive fibrosis, the effect of these two courses may offset each other, this may be the reason why no influnence of cardiac index was observed. At chronic stage, collagen increased widely whic

9、h is the result of reactive fibrosis, the proliferous collagen impaired greatly the cardiac function. Intervening by Losartan could improve cardiac function through suppressing reactive fibrosis during chronic phase of viral myocarditis. 【Key words】losartan myocarditiscollagenheart function tests尸检或

10、心内膜心肌活检证实,病毒性心肌炎慢性期主要病理解剖特点为心脏间质纤维化，但此点是否是患者心功能障碍的原因，尚不清楚。型、型胶原是心脏间质的重要成分，其中由型胶原为主组成的粗纤维较为强硬，含量稍增即影响心脏顺应性1，2。现已知病毒性心肌炎急性期胶原增生已经启动，但其作用是对坏死心肌的修复，即修复性纤维化3。因此，观察病毒性心肌炎恢复期及慢性期心脏胶原表达及其对心功能影响的规律，可以帮助我们全面了解病毒性心肌炎心肌间质的病理变化过程，为临床治疗病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化提供实验依据。大量资料证实，血管紧张素受体拮抗剂可明显抑制心脏间质胶原的合成过程，我们应用其代表性药物氯沙坦(losartan)

11、对此问题进行了初步的探讨。材料与方法一、动物模型的制作5周龄雄性Balb/c小鼠，腹腔接种柯萨奇B3病毒（CVB3）1×103 PFU 0.4 ml后，随机分为两大组。第一组为病毒性心肌炎恢复期动物，接种病毒后至12天随机分为A组(n=18)、B组(n=28),另设腹腔接种不含病毒的Eagles液后常规饲养的正常小鼠为C组(n=10)；其中B组经口饲氯沙坦10mg.kg-1.day-14，A、B两组均用高蛋白饲料喂养；药物干预18天后，A组死亡11只，B组死亡16只，C组没有死亡。第二组接种病毒后30天，作为病毒性心肌炎慢性期动物随机分为D组(n=10)和E组(n=10),腹腔接种不

12、含病毒的Eagles液后常规饲养的正常小鼠为F组(n=7);其中E组管饲氯沙坦，剂量同B组；30天后，D组死亡5只，E组死亡2只，F组没有死亡。将存活小鼠称重后进行以下处理。二、心排血量的测定用阻抗微分法对所有小鼠心排血量进行测定5，并计算心指数。三、心肌标本的采集及处理心排血量测定后立即开胸取出心脏，滤纸吸干称重后沿左室长轴剪为两份。一份立即放入液氮冷冻保存,以备RNA的提取；另一份立即放入10%的中性福尔马林液,固定24小时后行组织化学处理。四、组织化学检查将组织按常规冲洗，不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋，切片（厚度5 m），常规H.E.染色，苦味酸天狼猩红胶原特异染色6。所

13、用试剂除特殊说明外，均购自北京天象人生物技术有限公司。组织化学照片均用Pharmacia 公司的Ultro Scan LX JI激光密度扫描仪进行扫描，扫描面积积分半定量分析。五、RT-PCR按照硫氰酸胍法提取心脏组织的总RNA，型胶原引物和GAPDH引物同时加入，PCR反应模板为2 l，RT-PCR常规进行,反应条件为:94、30秒，55、40秒，72、50秒，重复上述三步骤共30次循环。4放置或储存于-20。取PCR产物510 l，1.5%琼脂糖凝胶电泳，照相。型胶原、GAPDH的PCR产物片段长度分别为245 bp、196 bp。所有照片均用Pharmacia 公司的Ultro Scan

14、 LX JI激光密度扫描仪进行扫描，扫描面积积分半定量分析。六、统计学方法本研究所有数据均用SPSS软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。结果1.病毒性心肌炎恢复期B组与A组相比,病死率（FR）稍减低，存活小鼠心排血量(CO)及心脏指数(CI)未见明显改善，二者均明显低于正常对照组，统计学分析差异有显著性(表1)。表1恢复期三组小鼠之间CO、CI、FR的比较（±s）组别CO（ml/min）CI（10-2ml.min-1.cm-2）FR(%)A组（7只）1.17±0.05*1.91±0.18*61.1B组（12只）1.16&

15、#177;0.11*1.97±0.25*57.1C组（10只）1.67±0.082.44±0.180注：?与C组相比，P<0.0012.病毒性心肌炎慢性期E组与D组相比，FR明显减低，存活小鼠CO及CI明显升高，统计学分析差异有显著性（表2）。表2慢性期三组小鼠之间CO、CI、FR的比较（±s）组别CO（ml/min）CI（10-2ml.min-1.cm-2）FR(%)D组（5只）1.39±0.21*2.07±0.30*50E组（8只）1.86±0.092.57±0.1520F组（7只）1.99±0

16、.032.75±0.120注：?与E组、F组相比，P<0.0013.病理学及组织化学检查：病毒性心肌炎恢复期小鼠心肌仍可见坏死灶，但炎性浸润逐渐吸收，可见散在淋巴、单核细胞,间质内已经有较多的胶原纤维；药物干预组基本与心肌炎组相同，只是间质内罕见胶原纤维。苦味酸天狼猩红胶原特异染色偏振光显像：病毒性心肌炎恢复期小鼠心脏间质可见胶原增生，主要是I型胶原；胶原增生有束状排列（间质处）和团块状（病灶处）两种形态；而药物干预组小鼠心脏间质胶原表达明显降低。扫描积分分析结果：B组为3.46±1.50 AU*mm,明显低于A组（7.49±1.20 AU*mm），P<

17、;0.01；与C组（2.96±0.95 AU*mm)比，差异无显著性。病毒性心肌炎慢性期小鼠心脏间质型及型胶原可见大量增生，而药物干预组小鼠心脏间质胶原表达明显降低。扫描积分分析结果：E组为2.59±0.49 AU*mm,明显低于D组(8.44±3.30 AU*mm),P<0.01 ;与F组(2.83±0.52 AU*mm)相比, 差异无显著性。4.RT-PCR检测结果：病毒性心肌炎恢复期A组小鼠心肌I型胶原mRNA表达明显高于B、C两组, B、C两组差异无显著性（1）。半定量扫描结果：A组为2.61,B组为1.90，C组为1.67。病毒性心肌炎慢

18、性期D组小鼠心肌I型胶原mRNA表达明显高于E、F两组, E、F两组差异无显著性（2）。半定量扫描结果：D组为1.95, E、F两组分别为0.85和0.66。1病毒性心肌炎恢复期A组小鼠心肌型胶原mRNA表达水平明显增强，B组与C组差异无显著性(注：对照为pBR 322/Hinf I，2同此)2病毒性心肌炎慢性期D组小鼠心肌型胶原mRNA表达水平明显增强，E组与F组差异无显著性 讨论心脏间质胶原网络在心脏血管疾病的研究中逐渐受到重视，胶原代谢与多种心血管疾病的发生、发展关系，国内外已多有报道。许多资料表明，心肌胶原病理性增生可严重影响心肌顺应性，使心功能下降7。控制心脏间质胶原的代谢，在心脏血

19、管疾病的防治中具有重要意义。从病理学角度来讲，胶原增生分两种过程：修复性纤维化和反应性纤维化。作者曾报道，在病毒性心肌炎急性期阻断心肌胶原增生不利于心功能改善，提示病毒性心肌炎急性期胶原增生属修复性纤维化过程，有利于稳定心功能3。这与本研究结果有所不同。我们的实验结果提示，因病毒性心肌炎的急性期与恢复期、慢性期胶原增生的机制及性质不同，故急性期和恢复期、慢性期胶原增生对心脏功能的影响也就各有特点。在病毒性心肌炎恢复期，氯沙坦干预使心脏胶原表达明显降低,但心脏指数在干预组与非干预组小鼠差异无显著性。病理学检查发现，在病毒性心肌炎恢复期仍有心肌坏死灶，组织化学检查发现在心肌坏死区和非心肌坏死区都可

20、见到胶原增生，增生范围明显大于急性期，提示此时修复性纤维化与反应性纤维化对心肌功能作用正好相反的病理学过程并存，这与Silver等8的研究结果相近。氯沙坦干预虽可消除反应性纤维化对心功能的负面影响,但同时也阻断了修复性纤维化过程对心功能的正面作用,这可能是氯沙坦干预结果的原因。另外，从研究结果来看，病毒性心肌炎慢性期，氯沙坦干预后，小鼠心肌胶原表达无论从蛋白水平还是mRNA水平都下降，临床表现为病死率下降，存活小鼠心功能明显改善，提示胶原增生即心肌纤维化在病毒性心肌炎慢性期是影响心脏功能的一项原因。结果提示，在心肌炎慢性期用药物消除慢性心肌炎患者的心肌纤维化确可改善病情，有利于预后。结合已发表

21、的资料可以看出,病毒性心肌炎急性期炎症引起的组织坏死可能启动了心肌胶原增生过程,随着组织的自身修复,纤维化的性质发生了变化,从急性期到恢复期、慢性期可以描述为:修复性纤维化发展为修复性纤维化+反应性纤维化、再发展为反应性纤维化这样一个动态过程。而在病毒性心肌炎的恢复期干预心肌纤维化是否有利尚难肯定，有待进一步研究。目前已知，在高血压性左室肥厚心肌内型胶原表达增加，可使心脏顺应性下降，僵硬度增加，进而引起心脏功能障碍1。但这是否也是慢性心肌炎心功能不全的原因，尚不清楚。但病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化的特点和作用与急性期有所不同，病理学检查证实，在慢性期已无心肌坏死灶，其主要病理学特征为心脏间质纤

22、维化，即间质胶原网络中型、型胶原增生性重建，这在本研究的组织化学研究中已得到证实。而本研究的RT-PCR结果也表明,胶原表达在转录水平已经增高，提示此时增生的胶原是对慢性炎症的反应性增生，病理学意义应该与高血压左室肥厚的胶原增生机制类同，是反应性纤维化。增生的胶原降低心肌顺应性，引起心功能障碍，所以氯沙坦 干预可改善心功能。作者单位：100037 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心脏肺循环研究室（荆志成、程显声）；上海医科大学中山医院卫生部病毒性心脏病重点实验室（杨英珍）参考文献1Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease:the fibriller collagen network. J Am Coll Cardiol, 1989,13:1637-1652.2荆志成,程显声.心脏胶原网络及其病理学意义.中国循环杂志, 1998,13: 187-188.3荆志成,程显声,杨英珍,等.病毒性心肌炎急性期预防性干预心脏间质纤维化的实验研究.中华医学杂志,1998,78:699-701.4Atsuo Tnaka,Akira Matsumori, Wang Weizhong, et al.Angiotension II