新型纳升级毛细管刻蚀电喷雾质谱接口研究

1、新型纳升级毛细管刻蚀电喷雾质谱接口研究段继诚，刘和春，梁振，张维冰，张丽华，张玉奎(中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究中心，大连116023)摘要：对普通石英毛细管表面使用氢氟酸刻蚀技术进行刻蚀，并与商品化鞘流液毛细管电泳质谱接口(Sheathflow cE-MS interface)结合，将其改装成一种新型的纳升级电喷雾质谱接口 玻璃膜接口部分呈多孔结构，壁厚约10 m以细胞色素e对新型接口加以评价，样品的流量最低可达到20 nLmin；在50500nLmin流量范围内刻蚀接口具有较高的响应信号考察了接触电解质溶液对样品电离的影响；比较微升级不锈钢接口和新型接口的蛋白质检测结果发现，

2、在流速为200 nLmin时，检测灵敏度可以提高36倍。详见：关键词：质谱；电喷雾接口；氢氟酸刻蚀；蛋白质检测随着电喷雾(ESI)技术的发展， ，使质谱与液相色谱(电泳)等多种液相分离技术的在线联用成为可能目前，液相分离质谱联用技术已成为蛋白质组研究中强有力的分析手段3,4 随着毛细管区带电泳(CZE)5、毛细管等电聚焦(CIEF)6、毛细管电色谱(CEC)7 以及微柱液相色谱8等微分离技术的日趋成熟，其与质谱联用的装置构建和方法的建立也得到较快发展与传统联用技术相比，微分离系统与质谱联用具有更高的分离效率、更快的分析速度和更少的样品消耗量，并且在低流速下，样品具有更高的电离效率，可以大幅度提

3、高质谱的检测灵敏度9.接口技术是ESI质谱与微分离系统结合的关键目前已报道的多种纳升级ESI接口主要有金属涂层10-12 、导电聚合物涂层13¨ 以及石墨涂层14等，然而它们都存在制作复杂及寿命短等缺点不锈钢制作的接口也被用于纳升级喷雾15，但这类接口在使用过程中会出现金属降解以及多点喷雾等问题16Janini17埔 和Whitt等19¨ 先后使用氢氟酸对石英毛细管外壁进行刻蚀，开发了一种毛细管电泳与质谱联用的无鞘流液接口这种接口不仅使检测灵敏度得以提高，而且具有稳定性好及使用寿命长等特点，尤其适宜于低流量下的质谱检测本文基于无鞘流液接口的制作原理，将用氢氟酸刻蚀后的毛细管

4、放人商品化鞘流液接口的不锈钢套管中，改装成一种新型纳升级流量ESI接口通过对蛋白质样品的分析，-考察了接触电解质溶液的组成和pH值对样品电离的影响与商品化微升级ESI接口比较结果表明，新型接口更加适合于在纳升级低流量状态下工作1 实验部分11 仪器与试剂注射泵(美国Harvard公司)，LCQduo离子阱质谱(美国Finnigan公司)，电喷雾接口(美国Finnigan公司)，工作站及数据处理系统(美国Finnigan公司)，高压电源(上海Unimicro Technologies公司)，扫描电子显微镜(日本JEOL公司)，石英毛细管。细胞色素c均购自美国Sigma公司，乙腈(色谱纯)购自德国

5、Merck公司，氢氟酸(体积分数为40)和乙酸为分析纯，其它国产有机试剂均为色谱纯无机试剂为分析纯所有实验用水均经过Mili-Q系统处理。12 刻蚀接口制作截取一段石英毛细管(50 m id，375 m od)，用煤气灯在适当部位处小火灼烧，使其均匀受热软化后，缓慢拉伸，当毛细管内径减小至约20 m后，停止拉伸，在显微镜下用硅片截取所需要的长度在距内径缩小端5 cm处，将毛细管外的聚亚胺涂层去除约5 mm将裸露出的石英部分浸泡在适当浓度的氢氟酸水溶液中，约3 h后，在刻蚀部分内外两侧充满电解质溶液，施加约2 kV电压，有电流通过即可停止反应用清水将刻蚀部分表面的氢氟酸清洗干净后，直接置入商品化

6、接口的不锈钢套管中备用，示意图见图1。13 质谱测定样品：细胞色素C；缓冲溶液：50 mmolL乙酸水溶液(含体积分数为50的ACN)质谱条件：喷雾电压2 kV，正离子模式；鞘流气：30 unit；毛细管末端与加热毛细管间距离：4 mm；加热毛细管温度：200 ；离子扫描范围，mz：4002000。2 结果与讨论2.1 刻蚀接口的制作及表征石英的化学性质稳定，仅可溶解于含有氟离子的溶液中石英毛细管表面经过氢氟酸刻蚀后，可形成一种多孔层状结构当石英层达到一定厚度时，在电场作用下体积较小的带电离子能够自由穿过多孔石英层；如果刻蚀过度，接口部分将变得脆弱，容易折断实验发现，当电流能够通过刻蚀部分的石

7、英壁时，管壁厚度在lO20 m范围内图2是刻蚀接口的扫描电镜图其中图2(A)和(B)分别为其横截面的电镜图，管壁厚度十余微米图2(c)是刻蚀毛细管的外壁扫描电镜图，可以清晰地看到在毛细管外壁已形成均匀的多孔状结构，孔的大小在数十纳米在刻蚀后的管壁两侧施加上电场，离子可以在其中迁移，实现毛细管壁两侧的电通路。(A)Cross-sectional view；magnification：1000 ；(B)partial view of the crosssection；magnification：2500 ；(C)partial view of the outer suiltce of the et

8、ched porous section；magnification，50000×为了得到较好的喷雾效果，需要将靠近质谱仪一侧的毛细管末端进行拉伸，使末端出口的内径缩小，从而有利于电喷雾20。如 将毛细管末端内径控制在20 Ixm左右，可以取得较好的喷雾效果，同时接El的使用寿命也较长如果末端内径小于10 m，毛细管将容易出现堵塞。将制作好的刻蚀接El置人商品化CE-MS接口的不锈钢管内，并在管中通入电解质溶液，利用电解质溶液的导电作用，实现接口内样品溶液与不锈钢管的电通路由于通人的电解质溶液主要起导电的作用，因此可称之为接触电解质溶液。在显微镜下观察，连续使用1个月后接口部分的外观无

9、明显变化对蛋白质进行连续检测，质谱响应的信号没有显著的下降说明新型接口的耐用性较好，优于现有的商品化纳升级接口。2.2 刻蚀条件的优化石英毛细管刻蚀的成败主要取决于反应温度和氢氟酸的浓度温度低时刻蚀速率较低，在4下使用体积分数为40的浓氢氟酸刻蚀12 h后接口仍不能满足要求温度升高至25 ，反应约4 h后。接13部分导电顺畅，说明升高温度有利于刻蚀反应的进行由于氢氟酸为挥发性酸，腐蚀能力强，不宜进一步升高温度，因此选择25作为反应温度。考察了氢氟酸浓度对毛细管刻蚀的影响在室温条件下，使用体积分数为20 的氢氟酸，反应10 h后，接口部分仍无法让电流通过；当氢氟酸的体积分数升高至40时和反应约4

10、 h后刻蚀即可完成虽然使用高浓度氢氟酸可提高刻蚀速率并缩短反应时间，但刻蚀过快，会破坏接口外壁的均匀性，在实验中选择在25条件下先用体积分数为40的氢氟酸刻蚀35 h后，再更换体积分数为20的氢氟酸进行刻蚀的反应条件在显微镜下观察，制得的接口均匀性良好。2.3 刻蚀接口用于蛋白质分析使用细胞色素c对刻蚀接口的性能进行考察图3为在50 nLmin流量下于2 min内得到的质谱图图3(A)和去卷积处理后的谱图图3(B)在所使用的流速条件下蛋白质具有较高的响应信号，最高丰度离子的响应值可达到815×lO7 经过去卷积化处理后，蛋白质的检测信号可以达到521×108F ·

11、3 MS spel'llln ofjtodlome C(A)and the deconvolulion spect唧of cytochrome C(B)Conditions：the mass concentration of eytoehrome 13；02 mgmL(50 mmolL HAc with 50ACN)；flow rate：50 nLmin；contacting buffer 2 50 mmolL NH4Ae(pH；70)；MS conditions：spray voltage：45 kV；the distance betweenspray tip and heated

12、capillary：064 ram；an alysis time：2 min表l中给出了不同流速下细胞色素C的质谱检测结果随着流速从2O nLmin增大到l IxLmin，最大丰度离子的mz值由11245变为了8249，其所带电荷也由+l1增加到+l5这说明随着流速的增加，蛋白质分子可以结合更多质子，使得最大丰度离子的mz值减小多电荷离子簇的分布向低mz端移动，表明在电喷雾时，蛋白质所处环境的pH值随着样品流速的增加而降低。2.4 接触电解质的影响分别使用不同含量的甲酸、乙酸和氨水作为接触电解质溶液，考察其对蛋白质检测的影响从图4可见，使用酸性接触电解质溶液时，蛋白质具有较高的响应信号，并且信

13、号强度随着酸含量的增加而增大其中酸性更强的甲酸比乙酸的作用更加明显碱性接触电解质溶液对响应信号有抑制作用当氨含量增加到05时，响应信号消失在施加喷雾电压后，在刻蚀部分石英壁两侧形成电场，体积较小的带电离子在电场作用下能够自由穿过多孔石英层，引起样品溶液与接触电解质溶液中离子的交换如果样品和接触电解质的pH值不相同，接口处的离子迁移和交换作用会减小这种差异，使得在刻蚀位置溶液的pH值趋于一致结果导致在正离子检测模式下，质谱的响应信号随着接触电解质中酸含量的增加而增高，而当使用碱性的接触电解质时，信号随碱含量的增加而减弱，最后完全抑制了信号的产生在低流速时，刻蚀接口壁两侧的离子交换较为充分，样品溶

14、液被接触电解质溶液中和，使得在喷雾口时样品溶液的pH值上升，形成的离子簇结合的质子数较少，最大丰度离子的荷质比较大；当流速增大后，接口处的离子交换速率变化小(电流值变化小)，样品溶液中和不完全，样品溶液pH值较低，蛋白质分子可以结合较多的质子，使得最大丰度离子的mz值减小。2.5 新型接口与商品化接口的比较分别使用刻蚀接口和商品化微流量接口对细胞色素c样品进行检测，结果如图5从图5可以看出，对于两种接口，响应信号皆随着流速增加而增加使用商品化接口时，在流量低于200 nLmin以后，质谱响应信号消失，说明该接口不适合在低流量下工作；而使用刻蚀接口可以在低至50 nLmin的流量下进行样品分析，

15、并且在500 nLmin以下流量范围内都具有较高的响应信号，性能优于商品接口，说明使用刻蚀接口能够改善蛋白质的电离效率，提高检测灵敏度在流速为200 nLmin时，检测灵敏度可提高3，6倍，在流速高于500 nLmin以后，电喷雾开始脱离“质量敏感响应区”9，质谱响应信号不再随流速的增加而升高进一步提高流速，喷雾液滴直径变大，喷雾效率降低，质谱响应信号甚至开始降低，表明刻蚀接口更适合于在纳升级流量范围内工作。参考文献1 Fcnn JB，Mann M，Meng CK，et a1Mass SpcctromRevJ，1990，9(1)：37_7O2 Fenn JB，Mann M，Meng CK， a

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