涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA的筛选

1、·基础研究·涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关微小RNA的筛选林钊宇李劲松武东辉张伟黄洪章潘朝斌陈伟良黄志权王友元【摘要】目的探讨不同转移能力涎腺腺样囊性癌(ACC表达微小RNA(miRNA的差异,以期筛选与ACC侵袭转移相关的miRNA及其所调控的靶基因。方法以ACC高转移细胞株(ACC-M为实验组,低转移细胞株(ACC-2为对照组,采用高通量miRNA微阵列初步筛选两株细胞中差异表达的内源性miRNA,然后挑选几个显著差异表达的miRNA,采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR进一步加以验证,同时运用miRNA靶基因预测软件预测其可能调控的靶基因。结果芯片初筛显示,与AC

2、C-2相比,ACC-M中表达差异具有统计学意义的miRNA 分子有23个,其中上调表达的有14个(miR-15a、miR-16、miR-509-3p等,下调表达的有9个(miR-24、miR-98、miR-320等。qRT-PCR验证与miRNAs芯片结果相符合。靶基因软件预测显示,miR-98的靶基因为Ras和高迁移率蛋白A2,miR-320的靶基因为整合素3,miR-509-3p 的靶基因为CD164,它们均与恶性肿瘤侵袭转移有关。结论不同转移能力的ACC存在差异表达的miRNA、miR-98、miR-320和miR-509-3p可能与ACC侵袭转移相关,可能通过调控相关靶基因参与ACC的

3、侵袭转移进程。【关键词】微小RNA;涎腺腺样囊性癌;侵袭;转移;靶基因Screening of differentially expressed microRNA related with invasion and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma LIN Zhao-yu*,LI Jin-song,WU Dong-hui,ZHANG Wei,HUANG Hong-zhang,PAN Chao-bin,CHEN Wei-liang,HUANG Zhi-quan,WANG You-yuan.*Department of Ora

4、l&Maxillofacial Surgery,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou510120,ChinaCorresponding author:LI Jin-song,Email:lijinsong1967【Abstract】Objective To investigate the differentially expressed microRNAs and their target genes related with invasion and migration in salivary g

5、land adenoid cystic carcinoma (ACC.Methods ACC-M(experimental groupand ACC-2(control groupcells were cultivated, and their endogenous different microRNAs were screened by high-throughput microRNA microarray,and then several significant different microRNAs were selected to be verified by qRT-PCR assa

6、y.Meanwhile,their target genes were predicted by miRNA target gene predictionDOI:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2010.06.005基金项目:国家自然科学基金(81072225;广东省自然科学基金重点项目(10251008901000022;广东省自然科学基金(915100890100 0201;广州市科技计划项目(2008Z1-E201作者单位:510120广州,中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科(林钊宇、李劲松、张伟、潘朝斌、陈伟良、黄志权、王友元;广州市海珠区口腔医院(武东辉;中

7、山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所(黄洪章通信作者:李劲松,电子邮箱:lijinsong1967programs.Results MicroRNA microassay showed that23microRNAs were changed in ACC-M compared with that in ACC-2,including a set of14overexpressed microRNAs(miR-15a,miR-16,miR-509-3p,et al.and9downexpressed miRNAs(miR-24,miR-98,miR-320,e

8、t al., which was accordant with the results of qRT-PCR assay.Ras and HMGA2were the predicted target genes of miR-98,and ITG3and CD164were the target gene of miR-320and miR-509-3p respectively,which were all related with invasion and migration.Conclusions There are differentially expressed microRNAs

9、between ACC-M and ACC-2.MiR-98,miR-320and miR-509-3p might involve in the process of invasion and migration of ACC by regulating the expression of its target genes.【Key words】MicroRNA;Adenoid cystic carcinoma;Invasion;Migration;Target gene涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC是涎腺中常见的恶性肿瘤,具有嗜神经侵袭性,其远处转

10、移发生率可高达26%40%,主要转移部位是肺1。目前针对ACC主要采取外科手术为主,放疗和化疗为辅的治疗方式。但是,对于已经发生远处转移的患者,由于尚无分子靶向治疗药物,所以疗效较差,五年生存率较低。目前,微小RNA(microRNA,miRNA与恶性肿瘤侵袭转移的关系成为人们关注的热点。miRNA是一类长度为1825个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA,通过与靶基因的mRNA碱基配对,使mRNA降解或抑制mRNA 的翻译,在转录后水平沉默靶基因2。有研究表明,恶性肿瘤侵袭转移与miRNA的异常表达有关系3。ACC既然具有高侵袭转移的生物学特性,miRNA是否在其侵袭转移中起到重要作用呢?国

11、内外未见相关研究报道。本研究应用miRNA芯片检测,qRT-PCR验证,靶基因软件预测,筛查出一组可能与ACC侵袭转移相关的特异miRNA及其靶基因,为进一步研究相关miRNA在涎腺腺样囊性癌侵袭转移的生物学机制打下基础。材料与方法一、材料ACC的肺高转移细胞株ACC-M和低转移细胞株ACC-2均购自四川大学华西口腔医学院。二、实验方法1.细胞培养:将冻存的细胞株复苏后,置于含10%胎牛血清的BPMI1640培养基,375%CO2恒温细胞培养箱中培养。每隔12d换液,46d传代1次。2.细胞总RNA提取和质量检测:取对数生长期的2株细胞Trizol裂解后进行总RNA抽提,提取的总RNA采用琼脂

12、糖凝胶电泳进行质量检测。3.miRNA的分离、富集、标记和纯化:对提取后的总RNA,采用mirVana TM RNA(Ambion,美国分离试剂盒抽提并富集miRNA,然后采用mirVana TM RNA标记试剂盒(Ambion,美国,向miRNA样品中加入Poly(A酶聚合反应的混合物,对富集的miRNA进行单色CY3荧光标记,再采用QIAgene PCR纯化试剂盒(QIAGEN,德国对标记的miRNA进行纯化并收集。4.miRNA检测微阵列制作:miRNA探针文库购自Invitrogen公司,所有探针长度在3444碱基长度,Tm值一致。共有1199个探针,包括703个人类已知的成熟miRN

13、A分子、393个已名称miR-98 miR-24 miR-320a miR-320c miR-23b miR-509-3p 引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物正向反向正向反向正向反向正向反向正向反向正向反向序列(53GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACAACAATCTGAGCGGTGAGGTAGTAAGTTGTAATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTGTCGCATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTCAACGAATGCGACCTGTTCACTAAGCTGGC

14、TCAGTTCAGCAGGATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTGTCGCATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTCAACGAATGCGACTCGCCCACTATGGAAAAGCTGGGTTGAGAGATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTGTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACACCCTCACTAAGCGAAAAGCTGGGTTGAGATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTGTCGCATTGCATGAGAGATCACTAGCGTCATGCAATGCGACGGTAATACTAAGATCACATTGCCAGGGAATTGCATG

15、AGAGATCACTAGCGTGTCGCATTCCTTGAGAGATGACTACCGACAAGGAATGCGACCTACCCACTTAGGTGATTGGTACGTCTGTGATTCCTTGAGAGATGACTACCGA表1miRNA实时定量RT-PCR的引物测序的预测的miRNA分子以及其他为各种阴性、阳性对照和外参照分子。关于此文库的详情,可参见Invitrogen公司的网站( 3。采用GE AMERSHAM公司的芯片点样仪点制在FULLMOON公司提供的PowerMatrix标准Oligo芯片片基上,按照标准流程进行固定,干燥保存或用于芯片实验。每张芯片包括左右2个重复的点样区,最后可以产

16、生2组重复的数据。每个区域包括从上而下共12个小方阵,每个小方阵分为8行16列共128个探针点,点间距约为350nm,点的直径约为230nm。5.芯片杂交、芯片扫描和图像结果分析:按照实验要求将变性的探针加到芯片上,盖上盖玻片,放入杂交舱并封好,放置于37空气浴摇床中以300r/min速度晃动1824h。杂交结束后,洗片干燥,玻片完全干燥后,放入扫描片夹中,利用扫描仪(Generationarray scanner,Amersham Pharmacia进行扫描;扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant5.0;Array Vision6.0,随后进行数据分析和处理。6.qR

17、T-PCR验证:采用MX-3000P实时RT-PCR仪(Stratagen,美国,相应的PCR引物见表1。7.生物信息学分析:应用3种miRNA靶基因预测软件(Targetscan、Pictar、MiRand的在线服务站点,输入显著差异表达的miRNA,为了减少假阳性率,挑选至少出现在2个靶基因预测软件中的基因作为其可能的靶基因。结果一、总RNA提取及质量鉴定结果电泳结果显示,两组样品总RNA均可见清晰的18S和28S条带,样品质量较好(图1。对分离纯化获得的miRNA进行吸光度(A值测定表明miRNA总量及质量符合miRNA微阵列的检测要求(表2。编号12345678910111213141

18、51617181920212223miRNA hsa -miR -15a hsa -miR -16hsa -miR -181c hsa -miR -22hsa -miR -222hsa -miR -801hsa -miR -561hsa -miR -29a hsa -miR -342-3p hsa -miR -378hsa -miR -509-3p hsa -miR -299-5p hsa -miR -514hsa -miR -518b hsa -miR -24hsa -miR -23b hsa -miR -98hsa -miR -320hsa -miR -126hsa -miR -187hs

19、a -miR -214hsa -miR -29b hsa -miR -877ACC -M/ACC -22.113.072.403.112.582.033.102.492.072.073.753.113.125.520.500.430.450.500.260.200.300.220.31表3芯片上存在表达差异具有统计学意义的miRNA 样品ACC -M ACC -2A 2601.0071.216A 2800.5620.665A 260/A 2801.791.83总RNA 浓度(g/l 0.80560.9728RNA 总量(g 80.5697.28miRNA 浓度(g/l 0.09120.1576

20、miRNA 总量(g 9.1215.76表2两组样品总RNA 和miRNA 的浓度及总量二、miRNA 芯片筛选结果对于miRNA 分子表达变化的显著性,按照通常的判断标准是校正后的两个样品间杂交信号强度的比值(ACC-M /ACC-2大于2为上调或小于0.5为下调。与ACC-2相比,在ACC-M 中具有显著性表达变化的miRNA 分子有23个,上调表达14个,下调表达9个(表3 。图1两组样品总RNA 电泳图三、miRNA 芯片筛选数据图以每个样品中miRNA 表达水平的校正数据为基础,表达水平高低以颜色梯度变化显示,没有检测到表达的数据以0表示,构成数据图(图2。四、qRT-PCR 验证结

21、果挑选miR-98、miR-24、miR-320a 、miR-320c 、miR-23b 、miR-509-3p ,通过荧光定量RT-PCR 方法来验证,与芯片筛选结果基本一致(图3。五、靶基因预测结果miR-24与细胞周期和增殖有关的靶基因为MKK4、MYC 、E2F2,与DNA 修复相关的靶基因为H2AX ;miR-23b 与细胞增殖有关的靶基因为Smads ;miR-98与侵袭转移有关的靶基因为Ras 和高迁移率蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2;miR-320与细胞周期有关的靶基因为CDK6,与细胞增殖相关的靶基因为CD71,与血管生成有关的靶基因为胰岛

22、素样生长因子1(insulin-like growth factors-1,IGF-1,而与侵袭转移相关的靶基因为整合素3(integrin 3,ITG 3;miR-509-3p 与侵袭转移有关的靶基因为CD164。讨论侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特性,是导致肿瘤患者死亡的一个重要原因。恶性图2miRNA 芯片筛选数据图图3qRT-PCR 验证ACC-M 中几种miRNA 相对ACC2 的表达量变化568 中华口腔 医学研 究杂志（电 子版） 2010 年 12 月第 4 卷第 6 期 Chin J Stomatol Res （ Electronic Edition ） , Decembe

23、r 2010, Vol4, No6 肿瘤侵袭转移通常被认为与基因表达的改变有关 ， 由于 miRNA 在肿瘤组织中常常呈现异常 表达 ， 因此它在肿瘤转移中的作用成为肿瘤生物学行为研究的一大热点 。 近年来研究 miRNA 在不同组织 、 不同疾病状态下表达的报道日渐增多 ， 证实了 miRNA 参与生命 过 程 中 一 系 列 的 重 要 进 程 ， 包 括 发 育 、 造 血 、 器 官形成 、 细胞增殖凋亡 、 肿瘤发生和发展 ， 一些作为促癌基因和 肿瘤抑制基因的 miRNA 被鉴定出来 。 本课题组前期研究发现 ，miR-21 在舌鳞癌中异常高表 达 ，通过抑制癌细胞凋亡而扮演着促癌

24、基因的角色 4-5。 最近的研究发现 ，miRNA 在参与肿瘤的 侵袭转移中也发挥着重要的作用 6。 Ma 等 7在对具有侵袭转移能力乳腺癌细胞株的研究中发 现 miR-10b 异常高表达 ，Tsai 等 8发现在转移的肝癌中 miR-122 呈低表达 。 目前 miRNA 参与涎 腺腺样囊性癌侵袭转移的研究尚未见报道 。 本研究采用高通量的 miRNA 芯片技术筛选获得不 同转移能力的涎腺腺样囊性癌细 胞 中 差 异 表 达 的 一 组 miRNA ， 然 后 结 合 预 测 的 靶基因是否 与 肿 瘤 侵 袭 转 移 相 关 ， 采 用 荧 光 实 时 定 量 RT-PCR 进 一 步 验

25、 证 ， 基 本 确 定 miR-98 、 miR-24 、 miR-320a 、 miR-320c 、 miR-23b 、 miR-509-3p 可能与涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关 。 miRNA 是一组非编码 RNA，并不直接编码蛋白 ，主要通过降解靶基因的 mRNA 和抑制靶基 因 mRNA 的 翻 译 这 两 种 方 式 调 控 基 因 的 表 达 ， 因 此 筛 选 和 分 析 miRNA 的 靶 基 因 是 研 究 miRNA 生物学功能的起点 。 Ma 等 9的研究显示在乳腺癌细胞中高表达的 miR-9 通过直接作 用于抑癌的 E-cadherin 蛋白 ， 上 调 编 码 基 因

26、 VEGF 的 表 达 促 进 了 血 管 生 成 ， 导 致 小 鼠 肺 部 微 小转移灶形成 。 Valastyan 等 10检测到高表达的 miR-31 可以通过多种机制抑制乳腺癌细胞的 转移 。 Sachdeva 等 11在乳腺癌动物模型的侵袭转移研究中发现 ，miR-145 作为一种抑癌基因 ， 不但可以抑制肿瘤的生长 ， 还可以通过沉默肿瘤转移相 关 基 因 MUC1 ， 从 而 抑 制 肿 瘤 的 侵 袭 和肺转移 。 这些研究提示 ，miRNA 分子广泛参与了肿瘤侵袭转移过程中的基因表达调控 。 随 着计算机 RNA 组学 和 生 物 信 息 学 的 发 展 ， 现 在 已 经

27、 可 能 逐 一 找 到 miRNA 的靶基因 ， 从而揭 示它们的功能 12。 通过应用 Pictar、Targetscan、MiRanda 等 miRNA 靶基因预测软件，本研究发现 miR-98 的 靶 基 因 为 Ras 和 HMGA2，miR-320 的 靶 基 因 为 ITG3 ，miR-509-3p 的 靶 基 因 为 CD164 ， 这些编码基因均与恶性肿瘤侵袭转移有关 ， 进一步的干预实 验将 明 确 这 些 miRNA 在 涎腺腺样囊性癌侵袭转移中的生物学调控机制 。 参 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 考 文 献 Shi H ，Wang J ， Dong F ，

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