涎腺腺样囊性癌细胞对抗癌药物敏感性的研究

1、涎腺腺样囊性癌细胞对抗癌药物敏感性的研究【摘要】目的检测涎腺腺样囊性癌对抗癌药物的 敏感程度。方法采用MTT法测试了14种抗癌药物对SACC-83、ACC-2 和ACC-M等3个体外培养的涎腺腺样囊性癌细胞株的杀伤作用强度。结果3种细胞株对14种药物的敏感性大体相似而又有差别，在抗代谢类抗肿瘤药物中，对MT X、DNR、ADM、5-Fu、MMC的敏感性较强，在植物来源的抗癌药物中，对Taxol有明显的敏感 性。结论药物敏感性测定对临床选用有效的治疗涎腺腺样囊性癌药 物具有一定的价值。【关键词】腺样囊性癌化学敏感试验MTT分析法 A study on chemosensitivity test

2、of human salivary adenoid cystic car cinoma cell linesMao LiminYu ShifengSun Kaihuaet al（School of Sto matology,Beijing Medical University,Beijing 100081）【Abstract】ObjectiveTo determine the sensitivity of salivary adenoid cystic carcinoma cells to anticancer agents.Metho dsChemosensitivity tests of

3、14 anticancer agents for 3 human saliva ry adenoid cystic carcinoma cell lines were performed using the MTT assay to cla rify the sensitivity of the SACC-83,ACC-2 and ACC-M cell lines to anticancer age nts.ResultsThe sensitivity of the 3 cancer cell lines we re resemblance but slight different.3 cel

4、l lines were sensitive to MTX、DNR、AD M、5-Fu and MMC of anti-metabolism drugs and specially higher sensitive to Taxol which is one of the several plant-orginated anticancer drugs.Conclus ionSalivary adenoid cystic carcinoma cells are sensitive to severa l drugs which may have some value in clinical c

5、hemotherapy.【Key words】Salivary adenoid cystic cancerChemo sensitivity testMTT assay腺样囊性癌是涎腺常见的恶性肿瘤，在手术治疗的同时，应用化疗 药物对提高治疗效果及防止远隔脏器转移具有重要意义。但由于药物选择性差，同时由于肿 瘤病理组织学分型、生长方式及分化程度不同，对各种化疗药物的敏感性也存在着差异。为 了更有效地应用已知的抗癌药物，预测腺样囊性癌对药物的敏感性，指导临床治疗以提高疗 效，我们选用了3种腺样囊性癌实体瘤细胞株，用MTT(四氮唑盐)法进行了肿瘤细胞体外药物 敏感性试验。材料和方法1.细胞系：人涎

6、腺腺样囊性癌细胞株SACC-83为本院建立，ACC-2及高转移细胞 株ACC-M引自上海第二医科大学口腔医学院。常规培养于含15%小牛血清的RPMI-1640培养液 中。2.化疗药物及浓度设定：ADM(阿霉素，意大利 FARMI TALTR CRRLOERBALtd生产)；CDDP(顺 铂，山东德州制药厂生产)；5-Fu(5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业有限公司生产)；DNR(柔 红霉素，意大利FARMITALIA CARLO ERBA 生产)；MMC(丝裂霉素，日本协和发酵工业株式会 社生产)；MTX(氨甲蝶呤，上海华联制药有限公司生产)；Ara-C(阿糖胞苷，上海华联制药有 限公司生产)；P

7、YM(平阳霉素，天津市河北制药厂生产)；VCR(长春新碱，上海华联制药有限 公司生产)；HRT(三尖杉脂碱，北京协和药厂生产)；HPT(羟基喜树碱，黄石飞云制药有限公 司生产)；Taxol(紫杉醇，中国医学科学院药物研究所提供)；Vp-16(鬼臼乙叉甙，北京制药 工业研究所实验药厂生产)，榄香烯乳(大连金港制药有限公司生产)。以上14种药物根据抗 肿瘤药体外实验用常用参考浓度1及参考下述公式推算 2：每种药物设置4个浓度。3.药物敏感性MTT测定法：将处于指数生长期的肿瘤细胞加入适量Trypsin-EDTA液，使贴壁 细胞脱落配成悬液，按每孔2103个(100l)接种于96孔平底培养板中，将平

8、板置37、 5%CO2、100%湿度培养箱中24小时后，加入含有不同浓度受试药物的培养液100l，每个 药物不同浓度设平行的三个孔，对照组加不含药物的培养液100l，再放入培养箱中孵育72 小时，用快速翻板法倒掉培养液，每孔加入用无血清1640按0.4g/ml配制的MTT溶液10 0l，温育4小时，使MTT还原为甲月替，再次倒 掉上清液，每孔加DMSO(二甲基亚枫)150l，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪(日本产，BID -RAD550型)在570nm波长处测定、打印每孔的OD(光密度)值。4.统计分析：各药物等级重复孔计算OD值均数，并按以下公式计算抑制率：用krber法计算出各种药物的细胞半

9、数抑制浓度(IC50)；根据临床每日常规用药剂量按以下公式计算出体外试验用药物浓度3：体外试验药物浓度(g/ml)=(50D)500050%103；D：临床用药剂量(mg.kg-1/day)，按每毫升含细胞培养液加50l体外试验药物浓度 计算剂量。临床用药剂量参照文献1，取静脉注射用量的平均值。体外试验药物浓度IC50为敏感；体外试验药物浓度IC50为不敏感或耐药， 并计算出二者的比值(敏感强度)。结果一、抗癌药物对三个细胞株的抑制作用：根据OD值求出药物对癌细胞的抑制率， 并计算出IC50值(表1)。表114种抗癌药物对三个细胞株的杀伤作用药物IC50(g/ml)SACC-83ACC-2AC

10、C-MADM0.1720.3850.355CDDP0.7940.6870.6185-Fu0.4740.3210.460DNR0.0360.0470.036MMC0.1000.0540.047MTX0.0070.0080.060Ara-C6.2626.22013.373PYM0.8090.6840.370VCR0.0080.0560.057HRT0.5480.4120.456HPT0.0500.4610.518Taxol0.0010.0030.004Vp-1610.00812.79713.614榄香烯乳32.27821.48724.897二、腺样囊性癌三个细胞株对14种抗癌药物的体外试验用剂量的

11、敏感性(表2) 。 表214种抗癌药物体外试验用剂量对三个细胞株的药敏感性药物体外敏感试验剂量g/ml药物敏感强度(与IC50比值)SACC-83ACC-2ACC-MADM1.3337.7503.4623.754CDDP0.5000.6290.7270.8095-Fu2.5005.2747.7885.434DNR0.60016.66612.76516.666MMC0.1151.1502.1292.446MTX0.12517.87515.6252.083Ara-C1.6650.2650.2670.124PYM0.3750.4630.5481.013VCR0.0253.1250.4460.438H

12、RT0.0650.1180.1570.142HPT0.0801.6000.1730.154Taxol2.6902690.000896.666672.500Vp-163.1250.3120.2440.229榄香烯乳8.3000.2570.3860.333讨论Mosmann最早报告了应用多孔扫描分光光度计(Elisa Reader)可精确测定细胞的生 长及存活，并用于药物对细胞的杀伤效果研究4。MTT化合物中与细胞作用的主要 成份四氮唑盐(Tetrazolium salt)是一种能接受氢原子的染料。活的肿瘤细胞线粒体中与辅 酶(NADP)相关的脱氢酶在细胞内可将黄色、水溶性的MTT还原为不溶性的蓝

13、紫色甲月替(formazan)，而死的细胞则无此功能。用DMSO将甲月替溶解后，在570nm的波长下用酶标仪测定OD值，即可测 出存活细胞数。以同一样品的不同药物浓度对细胞存活率作可得到剂量反应曲线，从中可 求出药物在不同杀伤程度时所需要的剂量。肿瘤细胞系MTT法药物敏感分析人为误差小而较 精确，结果与3H-TdR掺入法等化学敏感性试验结果有较好的一致性5，且 不需要放射性同位素。在新的抗肿瘤药物的体外筛选中，合成化合物或植物提取物纯品的IC5010g/ml或 植物粗提物的IC5120g/ml则可判定样品在体外对细胞有杀伤作用2， 在已知常用药物的剂量依赖性杀伤效应中，半数抑癌率剂量也可以反应

14、出各种药物杀伤效应 的差别。因为各种化疗药物的作用机制不同及临床用药剂量存在着差异，所以我们以临床化 疗时应用的剂量为基础，用公式计算出体外试验时相对应的药物敏感检测用剂量，同时比较 了其与IC50的关系，即计算出敏感强度，力求反应出在临床允许的药物剂量时，各种 受试药物对腺样囊性癌的抗癌效果。在14种抗癌药物对三个腺样囊性癌细胞系的药敏测定中，可以看出以下几个特点：在7种 抗代谢抗肿瘤药物中，有5种达到有效杀伤浓度，按药敏强度分析依次为MTX、DNR、ADM、5- Fu和MMC。在6种植物来源的抗癌药物中，以Taxol的杀伤效果最明显。被测试的3个细 胞系药敏性大致相似，但将每个细胞系对14

15、种抗癌药物的反应按敏感强度区分，又可得到不 同的序列，表明同一种肿瘤的不同细胞系中存在着异质性。在本实验中，测定了几种近年来 出现的植物来源的抗癌药物对腺样囊性癌细胞的杀伤效果，其中包括紫杉醇、三尖杉脂碱、 鬼臼乙叉甙和榄香烯乳等，其中效果最引人注目的是紫杉醇。紫杉醇是由短叶红豆杉树皮中 提取的复杂二萜类化合物，其作用机理与其它抗癌药物完全不同，它促进微管蛋白的聚合， 抑制其解聚，使细胞周期移行阻断在G2+M期，对抗药的人卵巢癌、乳腺癌及黑色素瘤有突 出的疗效，并对多种移植性肿瘤有明显的抑制作用，被誉为“九十年代发现的最主要的抗癌 新药”6。更可喜的是，近来有研究表明，紫杉醇和三尖杉酯碱对恶性

16、肿瘤细胞 侵袭和运动也有明显抑制作用7，是一种有前景的抗肿瘤转移药物。根据文献资料及化疗经验，Suen等(1982)提出CDDP、ADM、5-Fu对腺样囊性癌等较敏感，全 国涎腺肿瘤协作组也建议对其采用PVF方案。对比看来本试验结果与临床实际应用情况并不 全一致，这更进一步说明药敏试验的必要性；另一方面，此研究结果尚需经临床进一步验证 ，以确定其实际治疗效果。众所周知，目前临床使用的抗肿瘤药物均有较严重的毒副作用， 由于肿瘤存在着个体差异性及原发、继发的抗药性，即使同一组织学类型，分化程度相同的 肿瘤，也可以对同一药物的敏感性不同。因此，如果能够在化疗以前预先测定药物敏感性而 排除无效药物，就

17、具有重要意义。近年来应用显示出与临床有较好相关性的应用人类新鲜癌 组织的体外药敏试验，可以有效地应用化疗药物，预测个体肿瘤对药物的敏感性8 ，并用于指导临床治疗，以提高疗效。国内外已有学者将其作为常规性工作9，10 ，值得进一步研究、应用。作者单位：毛立民（北京医科大学口腔医学院100081）于世凤（北京医科大学口腔医学院100081）孙开华（北京医科大学口腔医学院100081）刘红岩（中国医学科学院药物研究所）徐少锋（中国医学科学院药物研究所）韩锐（中国医学科学院药物研究所）参考文献1，韩锐，主编.抗癌药物研究与实验技术.第1版.北京：北京 医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997，4

18、47.2，韩锐，主编.肿瘤化学预防及药物治疗.第1版.北京：北京医科大学、中国协和医科大学 联合出版社，1991，418.3，刘晓东，杨广育、赵玉琴，等.体外测试肿瘤化疗敏感性指标的研究，实用肿瘤学杂志， 1992，3：39.4，Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Appl ication to proliferation and cytotoxicity assays.J Immuno Methos,1998,65:55.5，近藤霆平.抗癌剂感受性试验临床应用课题.J Jpn Cancer Ther,1997,32:875.6，韩锐.抗肿瘤新药紫杉醇研究的进展.中国肿瘤临床，1993，20：223.7，刘红岩，雷小虹，韩锐.几种植物来源不同作用机制的抗癌药抗侵袭作用，药学学报，19 98，33：18.8，Shaw GL.Gazdar AF,Phelps,R,et al.Individualized chemotheotherapy for pati ents wit