盐酸尼卡地平毛细管电泳手性拆分研究

1、盐酸尼卡地平毛细管电泳手性拆分研究王园朝*1 ，罗经文2（1杭州师范学院材料与化学化工学院，杭州 310036 2浙江省疾病控制中心，杭州 310009）摘要：目的：以环糊精及其衍生物为手性试剂，研究血管扩张型降压药盐酸尼卡地平手性对映体拆分方法。方法：用区带毛细管电泳模式，考察了手性试剂的类型、浓度及缓冲溶液pH值等对分离度的影响。确定拆分盐酸尼卡地平手性对映体的最佳条件，并对其分离机理进行了初步探讨。结果：用-CD和羟丙基-,-CD(HP-,-CD)为手性试剂时，不能拆分或拆分效果不理想；高磺化(HS)修饰的环糊精对尼卡地平拆分的效果明显，其中尤以HS-CD拆分效果最好，达到基线分离。结论

2、 在拆分碱性药物对映体时，可在低pH条件下用带负电性的高磺化环糊精为手性拆分试剂。关键词：盐酸尼卡地平；对映体分离；高磺化环糊精；毛细管区带电泳 中图分类号：R917 文献标识码：AStudy on the Enantiomeric Separation of Nicardipine hydrochloride by Capillary ElectrophoresisWANG Yuan-chao1, LUO Jin-wen2(1 College of Material and Chemistry & Chemical Engineering, Hangzhou Teachers College

3、, Hangzhou, 310036 2 Zhejiang Provincial Center for Disease Control, Hangzhou 310009)ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the enantiomeric separation of Nicardipine hydrochloride by capillary electrophoresis using -CD 、HP-,-CD and HS-,-CD as the chiral selector. METHODS The effects of the pH, composis

4、tion and concentration of the runing buffer solution, the sort and concentration of chiral selectors on the mobility and chiral separation were studied. In addition, the mechanism on chiral distiguish was discussed. RESULTS HS-CD gave a basedline enantiomeric seperation for Nicardipine hydrochloride

5、, Whereas the -CD 、HP-,-CD showed poor stero-selectivity, and HS-,-CD gave just partial chiral seperation. CONCLUSION The high sulfonic cyclodextrins possessing negative charge tends to be more favorable for enantioseperation of the basic drugs in lower pH of the runing buffer.KEY WORDS: Nicardipine

6、 hydrochloride；Chiral separation；HS-,-CD；Capillary electrophoresis尼卡地平(Nicardipine，NCD)属第二代1,4一二氢吡啶类钙拮抗剂(DPHs)，通过抑制细胞外Ca的内流、松弛血管平滑肌而起到降压作用，用于低、中度高血压病。结构中二氢吡啶环上的4位C为不对称碳原子(图1)，存在两个对映体，因在药理活性上存在着明显差异1，对映体分离已引起人们广泛关注。目前对尼卡地平的手性分离大多是利用HPLC方法，固定相使用的手性选择剂主要有大环抗生素类2、多糖及纤维素类3,4、卵类粘蛋白5和卵类糖蛋白6等。毛细管电泳在手性分离方面具有

7、一定的优势，其手性分离的关键是手性试剂的选择，环糊精因其特殊的空穴结构，广泛应用于手性物质的分离。本文通过对几种类型环糊精衍生物的试验，建立了以HS-CD为手性选择剂的区带毛细管电泳新方法，成功地基线分离了盐酸尼卡地平的两个对映体。作者简介: 王园朝，男，教授 Tel: (0571)88484798 E-mail: wangyc2005浙江省分析测试基金项目（编号04110）图1 盐酸尼卡地平的结构式 Fig 1 Chemical structures of Nicardipine hydrochloride1 实验方法1.1 仪器与试药Beckman P/ACE MDQ 毛细管电泳仪，PDA

8、检测器，32Karat软件(美国Beckman公司)；熔融石英毛细管裸柱，60cm50m，有效长度为49cm(美国Beckman公司)；-环糊精(-CD)(广东郁南糊精厂)、羟丙基-,-环糊精(HP-,-CD)(Fluka)、高磺化-,-环糊精(HS-,-CD)(美国Beckman公司)；盐酸尼卡地平对照品(中国药品生物制品检定所)，配成浓度为1.0mg/mL的水溶液，1,3,6,8-pyrenetetrasulfonate(PTS)作标记物；其余试剂均为分析纯，水为去离子水。1.2 电泳条件 运行缓冲溶液含5%HS-(,)-CD的50mM三乙胺磷酸盐(pH2.5)；工作电压：-15kV(反向

9、电压)；检测波长：200nm，柱温：25；3kPa压力进样4s。2 实验方法2.1 运行缓冲溶液的制备 于一小烧杯中取1体积的20%HS-(,)-CD水溶液，1体积的水和2体积的100 mmolmL-1 H3PO4，在pH计上用三乙胺调到所需pH值。即可得到含5%HS-(,)-CD的50 mmolmL-1 三乙胺磷酸盐缓冲溶液。使用前用0.45m针筒过滤器过滤。2.2 对照品溶液的制备 准确称取10mg盐酸尼卡地平，用少量甲醇溶解后，配成10mL的甲醇/水溶液，即得浓度为1.0mg/mL的贮备液。置于冰箱中4保存。2.3 样品溶液的制备 用移液枪取200L浓度为1.0mgmL-1盐酸尼卡地平贮

10、备液，加入2L PTS混匀，置于仪器样品小管中即可。2.4 毛细管柱处理方法毛细管使用前用0.1 molL-1NaOH溶液和水分别冲洗2min，运行缓冲溶液冲洗2min。两次进样间依次用0.1 molL-1NaOH溶液、水和缓冲溶液各冲洗1min。3、结果与讨论3.1 手性试剂的选择本实验分别选择了-CD、HP-,-CD和HS-,-CD为手性选择剂。实验表明-CD、HP-,-CD对盐酸尼卡地平手性对映体分离没有明显效果，HP-CD虽有分离迹象，但迁移时间长，不能达到基线分离。HS-,-CD对手性拆分都有明显的效果，只是分离程度不同。HS-CD有分离迹象，HS-CD未到基线分离(RS=1.08,

11、 =0.025) ，而使用HS-CD时，尼卡地平的两个手性对映体分离完全(RS=2.2, =0.10)，故选择HS-CD进行下一步实验。3.2 缓冲溶液及浓度的确定 以HS-CD为手性试剂，分别以磷磷酸盐、磷酸盐-tris和磷酸盐-三乙胺进行试验，发现单纯的磷酸盐电流过大，焦耳热效应明显，谱峰拓展峰形拖尾；磷酸盐-tris为缓冲溶液时，抑制了电流，使峰迁移时间过长，分离效果不理想；磷酸盐-三乙胺作缓冲溶液时，迁移时间适中，基线稳定，峰形好且分离效果好。在2070 mmolmL-1范围内，改变缓冲溶液浓度，表明浓度在50 mmolmL-1时，两对映体分离效果最好。故选择50 mmolmL-1三乙

12、胺磷酸盐溶液为缓冲溶液。3.3 HS-CD浓度对对映体分离度的影响HS-CD浓度对盐酸尼卡地平对映体分离度(RS)的影响见图2。随着选择剂HS-CD浓度的增大，分离度增加，但同时离子强度增加，焦耳热效应增大。当HS-CD%5%(W/V)时，浓度对分离度影响程度减弱，浓度太高，分离时间变长，峰形变宽。因此选择5%HS-CD为最佳手性试剂浓度。3.4 缓冲溶液pH值对对映体分离度的影响因考虑到手性试剂与尼卡地平的充分作用，本实验选择在较强酸性条件下进行，此时抑制了毛细管内壁硅羟基的离解，基本消除了电渗流，溶质主要依赖缓冲溶液自身的电泳速度迁移。试验了pH值从14范围内变化对RS的影响，见图3。当p

13、H值较小时，一方面环糊精试剂与尼卡地平作用力加强，使分离变好，另一方面分离时间加长，使谱峰拓宽，分离度减小；当pH值较大时，毛细管壁硅羟基部分离解，有吸附现象基线不好，样品与手性试剂相互作用力减弱，分离效果变差；当pH=2.5时，基线稳定，且RS最好。故选择缓冲溶液的pH=2.5。3.5分离电压和柱温对对映体分离度的影响 柱温为25时，分离电压在10kV25kV范围内进行实验，发现当分离电压大于20kV时，因焦耳热效应的影响，谱峰变宽，尼卡地平未能达到基线分离；而当电压低于15kV时，分离时间变长，峰形拖尾；在分离电压为15kV时，温度从20到30间变化时(该仪器控温范围为室温5)，发现除对迁

14、移时间有影响外，对分离度影响不明显。综合考虑，本实验选择15kV和25为最佳分离电压和柱温。图2 HS-CD浓度对分离度的影响。Fig 2 Effect of HS-CD concentration on enantiomers separation of Nicardipine图3 缓冲溶液pH值对分离度的影响。Fig 3 Effect of pH on enantiomers separation of Nicardipine3.6 分离谱图在最佳条件下，盐酸尼卡地平分别在HS-,-CD三种手性选择剂存在下的对映体分离谱图如图4。显然HS-,-CD分离效果不理想，而HS-CD则对两对映体达

15、到基线分离，分离度为2.2。4 手性识别机理讨论尼卡地平含有脂烃胺基显碱性，在酸性缓冲溶液中，其胺基上的氮原子得质子成为季铵盐而带正电，与环糊精相互作用时，疏水性较强的苯基与环糊精内腔发生分子间作用力，而与苯基相联的支链上的胺基季胺盐可与环糊精外缘的上的修饰基团相互作用，对于中性-CD和HP-CD这种作用较弱，因而对尼卡地平的两个对映体没有产生明显的差异作用。HS-CD腔口修饰有大量带负电的磺酸基，与尼卡地平支链间除氢键作用外，还有静电引力作用，作用力较强。另外分离还与环糊精的内腔尺寸和分离对象分子大小相配匹有关，尼卡地平是一个大分子化合物， HS- CD内腔尺寸最大，与其最相配匹，因而对其两

16、对映体分离效果最好。由此可见，用高磺化环糊精拆分碱性药物对映体时，要比用中性环糊精有更好的分离效果。图5 分别以HS-,-CD为手性选择剂时，盐酸尼卡地平对映体分离谱图Fig 5 Chiral seperation electropherogram of Nicardipine hydrochloride a HS-CD as selector b HS-CD as selector c HS-CD as selector参考文献1 Jamali F，Mehvar R，Pasutto FMEnantioselective aspects of drug action disposition：t

17、herapeutic pitfallsJ. J.Phram. Sci198978(9)：695 -7152 Li L Y，QIAN B Y，GAO R Y，et alDirect Chromatography Resolution of Six Pharmaceutical Racemates on a Vancomycin Chiral Stationary Phase J Journal of Instrumental Analysis(分析测试学报)，2003，22(6)：83-853 GONG L，WANG S C，HE L CStudy on Separation of Dihydropyridine Calcium Antagonists Enantiomers on Chiralcel OJ Column.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(药物分析杂志)，2003，23(6)：399-4024 ZOU G W，ZHENG Q，HU G J. Cellulose Derivatives aS Chiral Stationary Phase in High-performance Liquid ChromatographyJ Chinese Journal of Ana1ytica1 Chemist(分析化学)，