白虎追风胶囊的抗炎作用机理

1、白虎追风胶囊的抗炎作用机理 摘要：为揭示白虎追风胶囊的抗炎作用机理，研究了白虎追风胶囊对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-)和前列腺素E2(PGE2)的影响，以及对AA大鼠血液中氧自由基和NO的影响。结果显示：白虎追风胶囊能下调AA大鼠滑膜过度分泌的IL-1、TNF-和PGE2；能降低AA大鼠过高的LPO和NO水平，使过低的SOD和GSH-Px增高。提示白虎追风胶囊的作用机制可能与其抑制滑膜分泌细胞因子和炎症介质，以及抗氧化作用有关。主题词：白虎追风胶囊/药理学；白虎加桂枝汤/药理学；关节炎，佐剂性/中药疗法；关节炎，类风湿/中药疗法；滑膜/分泌；白

2、细胞介素-1/分析；肿瘤坏死因子/分析；前列腺素E类/分析；脂质过氧化作用/药物作用；谷胱甘肽过氧化酶/血液；超氧化物歧化酶/血液；一氧化氮/血液中分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1007-3213(2000)01-0072-04Anti-inflammatory Mechanism of Baihu Zhuifeng CapsuleSHI Xuguang,HE Guoliang(Dept.of Traditional Chinese Medicine Formula,Guangzhou Universtiy of TCM,Guangzhou 510405,China)ZHOU J

3、ie(Graduate Class of Grade 96,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)Abstract:To reveal the anti-inflammatory mechanism of Baihu Zhuifeng Capsule(BZC),the effects of BZC on synovial interleukin-1(IL-1),alpha tumor necrosis factor (TNF)and prostaglandin E2 (PGE2),and blood oxygen free rad

4、ical and niric oxide(NO)in rats with adjuvant arthritis(AA)were observed.The results showed that BZC could reduce the hyper secretion of IL-1,TNF and PGE2,decrease serum lipid peroxides and NO contents and increase superoxide dismutase and glutathione peroxidase levels.It is indicated that the mecha

5、nism of BZC is probably related to the inhibition of synovial cytokines and inflammatory mediator and the antioxidation.Key words:BAIHU ZHUIFENG CAPSULE/pharmacology;ARTHRITIS,ADJUVANT/TCD ther.；ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD ther.;SYNOVIAL MEMBRANE/secret.;INTERLEUKIN-1/anal;TUMOR NECROSIS FACTOR/anal.;P

6、ROSTAGLANDINS E/anal.;LIPID PEROXIDATION/drug eff.;GLUTAHIONE PEROXIDASE/blood;SUPEROXIDE DISMUTASE/blood;NITRILES/blood白虎追风胶囊是在金匮要略白虎加桂枝汤的基础上加减而成的有效制剂，主要含有石膏、白芍、细辛、制川乌、桂枝等药。以往研究表明该方对类风湿性关节炎(RA)具有较好的抗炎、消肿及镇痛作用1，2。大鼠佐剂性关节炎(AA)是常见的RA实验模型之一，常用于RA发病机制的研究及抗炎药物的筛选3。本文通过观察白虎追风胶囊对AA大鼠关节形态学、病理结构、滑膜细胞功能和血液中氧自

7、由基等的变化，以求揭示其抗风湿的药理基础和作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物Wistar大白鼠50只，雌雄各半，23月龄，体重180220g，由广州中医药大学实验动物中心提供。1.1.2实验药品及主要试剂白虎追风胶囊：由广州中医药大学药剂教研室提供，每粒药粉(500mg)相当于5g生药的提取量(包括挥发油和浸膏)，实验时以蒸馏水配成80g/L溶液(低剂量)和160g/L溶液(高剂量)；雷公藤多甙片：上海医科大学红旗制药厂生产，批号971001；弗氏完全佐剂(FCA)、脂多糖(LPS)、型胶原酶均为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶(1250)，Difco产品进口分装；DMEM培养

8、粉，Gibco公司产品；白细胞介素-1(IL-1)试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司提供，批号980717；肿瘤坏死因子-(TNF-)试剂盒，北京东亚免疫技术研究所生产，批号980701；前列腺素E2(PCE2)试剂盒，苏州医学院提供，批号970719；一氧化氮(NO)测试盒，军事医学科学院研究所提供，批号971029。1.2方法1.2.1大鼠佐剂性关节炎(AA)模型制备按照文献方法4用弗氏完全佐剂于每只大鼠右后足跖皮下注射0.1mL致炎。1.2.2分组及给药方法将大鼠分为5组：正常组、AA组、白虎追风胶囊高剂量组(药高组)、白虎追风胶囊低剂量组(药低组)、雷公藤多甙对照组，每组10只，雌雄各半

9、。造模后2d即开始灌胃，连续28d，灌胃量为10mL/kg。正常组灌服生理盐水；药高、药低组分别灌服白虎追风胶囊高、低剂量溶液；对照组灌服雷公藤多甙混悬液。1.2.3踝关节病理切片观察于致炎后30d将大鼠处死，取大鼠右踝关节周围之软组织及关节滑膜，置10%福尔马林中固定，作常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。1.2.4大鼠滑膜细胞培养上清液的制备5于致炎后30d无菌取出大鼠双侧膝关节滑膜组织，经型胶原酶及胰蛋白酶消化后，分离成单个滑膜细胞，用含有5mg/LLPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5105/L)，加入24孔培养板内，每孔1mL，于37、5%CO2培养箱培养48h，收集上清液，

10、-40保存待测IL-1、TNF-和PGE2等活性。1.2.5滑膜细胞培养上清液IL-1、TNF-、PGE2活性的检测IL-1活性采用ELISA法检测，TNF-、PGE2活性采用放射免疫法检测，均按试剂盒说明书操作。1.2.6红细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定采用邻苯三酚自氧化法6。1.2.7全血谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性测定采用DTNB直接法7测定。1.2.8血浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法8测定。1.2.9血清NO含量测定按测试盒说明书进行

11、操作。2结果2.1对大鼠关节形态学和病理结构的影响表1结果显示，给药后7、14、21、28d白虎追风胶囊组大鼠右足肿胀率明显小于AA组，差别有显著性(P0.05或P0.01)。表明白虎追风胶囊对AA大鼠原发性病变有较好的治疗作用。表1白虎追风胶囊对AA大鼠足跖肿胀的影响()组 别N/只p右后足跖肿胀/%7d14d21d28dAA组1064.127.561.522.864.728.142.515.3药低组1043.111.3*33.720.6*40.618.0*24.816.8*药高组1040.011.2*34.812.3*3611.9*23.612.5*雷公藤组1042.815.3*41.11

12、7.1*48.911.421.312.5* *与AA组比较：P0.05，*P0.01病理切片结果显示，AA造模组大鼠踝关节周围软组织内见大量淋巴细胞、单核细胞浸润，并可见大量类上皮细胞反应，部分区域类上皮细胞聚集成团，形态颇似结核结节，类上皮细胞团周围有大量淋巴细胞、单核细胞聚集。滑膜上皮细胞增生，肿胀。肿胀之滑膜上皮细胞呈立方形，低柱状甚至成复层，上皮下见少量淋巴细胞及单核细胞浸润。白虎追风胶囊组滑膜上皮增生程度较轻，上皮及周围软组织内浸润之炎症细胞亦较造模组少，说明白虎追风胶囊对AA大鼠病变关节的病理组织结构有一定的改善作用。2.2对AA大鼠滑膜细胞分泌IL-1、TNF-和PGE2的影响表

13、2结果表明，AA大鼠滑膜细胞分泌IL-1、TNF-和PGE2的含量较正常组大鼠明显增高(P0.01)，白虎追风胶囊高、低剂量均可降低AA大鼠异常增高的IL-1、TNF-活性和PGE2含量，使其接近或恢复正常水平。表2白虎追风胶囊对AA大鼠滑膜IL-1、TNF-和PGE2的影响()组 别N/只IL-1/(ng.L-1)TNF-/(g.L-1)PGE2/(ng.L-1)正常组108.740.090.790.5446.671.71AA组1012.470.09*1.150.95*65.231.36*药低组109.890.090.990.2153.346.67药高组108.650.110.760.304

14、5.490.74雷公藤组106.260.18*0.590.47*24.533.52* *与正常组比较：P0.05，*P0.01；与AA组比较：P0.05，P0.012.3白虎追风胶囊对AA大鼠血液中LPO、SOD、GSH-Px和NO的影响各组动物于造模后30d眼球取血，分别检测红细胞SOD活性、全血GSH-Px活性、血浆MDA含量和血清NO含量。结果证明白虎追风胶囊组可以降低AA大鼠过高的LPO、NO水平，同时还使其过低的SOD和GSH-Px活性增高或恢复正常(见表3)。表3白虎追风胶囊对AA大鼠血液cMDA、JSOD、JGSH-Px和cNO的影响()组别N/只cMDA/(mol.L-1)JS

15、OD/(kU.L-1)JGSH-Px/(kU.L-1)cNO/(mol.L-1)正常组105.621.3126.624.7866.013.394.520.11AA组107.630.0421.914.3553.118.276.530.54药低组106.300.37*25.344.94*61.447.05*5.480.54*药高组105.960.19*27.203.45*63.895.82*5.050.50*雷公藤组105.640.37*27.782.71*68.397.20*4.380.53* *与AA组比较P0.05，*P0.01；与正常组比较P0.05，P0.013讨论白虎追风胶囊是由桂枝、

16、白芍、知母、石膏、白芷、薏苡仁、制川乌、细辛、黑老虎等药组成，具有清热祛湿、驱风通络止痛的作用。实验结果表明白虎追风胶囊对大鼠AA有良好的治疗作用，对AA大鼠病变关节的病理组织结构有一定的改善作用。细胞因子在RA的发病过程中起重要作用，其中以IL-1和TNF的作用较为突出。细胞因子刺激滑膜成纤维细胞、毛细血管内皮细胞高度增殖，构成RA特征性血管翳；刺激软骨细胞、破骨细胞产生前列腺素E2(PGE2)以及胶原酶等多种蛋白水解酶；激活中性粒细胞释放溶酶体酶、白由基等炎症介质，成为引起关节软骨、骨质等组织破坏，导致关节内粘连以及后期关节畸形的关键因素9，10。实验结果表明，白虎追风胶囊可降低AA大鼠异

17、常增高的IL-1、TNF-活性和PGE2含量，提示其对AA大鼠的治疗作用可能与其抑制滑膜分泌的细胞因子及炎症介质有关。文献报道11，氧自由基(OFR)和一氧化氧(NO)参与类风湿性关节炎和佐剂性关节炎的病理损伤过程。本文检测AA大鼠脂质过氧化物产物MDA含量可代表LPO水平，LPO水平不仅反映自由基产生的程度，而且还提示对机体损伤的强度。SOD清除、减少H2O2的生成，是代表机体内抗氧化能力的重要指标。GSH-Px清除H2O2，防止H2O2被进一步氧化为毒性更强的OH-。研究表明白虎追风胶囊可降低血浆LPO及血清NO水平，并提高机体内源性的抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性。提示其对大鼠AA的

18、治疗作用也可能与其提高机体抗氧化系统能力，清除过多的LPO及NO，减少自由基对机体的损伤有关。基金项目：广东省中医药管理局资助课题(No.96044)；广州中医药大学科研基金资助课题(No.97034)作者简介：施旭光，男，1965年出生，副教授，医学硕士；作者单位：施旭光(广州中医药大学方剂教研室，广州510405)周杰(广州中医药大学96级硕士研究生，广州510405)何国梁(广州中医药大学方剂教研室，广州510405)参考文献：1施旭光，高汉森，何国梁.白虎追风丸治疗早期“类风关”43例J.江苏中医，1998，(痛证专辑)：1422傅益群，赖天松，高汉森，等.白虎追风丸对痹证模型的血液流变学及形态学的影响J.中国中西医结合风湿病杂志，1998，7(3)：1483Panossian N,Heyner S,Pober J,et al.Humoral and cellular immunologic aspects of adjuvant and collagen arthritis in ratJ.Immunopharmacol,1986,8:3474徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学M.北京：人民卫生出版社，1985.7235王斌，陈敏珠，徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养J.中国药理学