姜黄素对单侧输尿管梗阻后肾间质纤维化的调节

1、姜黄素对单侧输尿管梗阻后肾间质纤维化的调节      作者：张彬 王全胜 朱锐 汪永辉 张丽晓 徐敏 刘建国 【摘要】  目的： 研究姜黄素在单侧输尿管梗阻(UUO) 大鼠模型中能否减少肾间质中转化生长因子1（transforming growth factor-1,TGF-1）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表达。方法: 将30只大鼠随机分为3组，每组10只：假手术组、模型组、姜黄素组。模型组和姜黄素组行右侧输尿管接扎术，假手术组只游离不接扎。术后第14天处死各组中的大

2、鼠，检测血液尿素氮（BUN）、血清肌酸酐（Scr）。用免疫组织化学方法测定TGF-1、CTGF的表达情况，同时采用Masson染色，观察肾脏病理情况。结果: 姜黄素降低了BUN、Scr的含量，同时姜黄素显著减少了大鼠肾间质TGF-1、CTGF的表达，并有效改善了肾脏的病理学损伤。 结论: 姜黄素可以减少输尿管梗阻后TGF-1、CTGF的表达，从而改善UUO所致的肾脏损伤，提示姜黄素可能有延缓慢性肾脏疾病纤维化进程的潜能。 【关键词】  输尿管梗阻； 纤维化； 姜黄素； 免疫组织化学； 大鼠，Spragua-Dawley； 肾间质     Abstract

3、 Objective: To verify if curcumin can decrease the expression of transforming growth factor-1(TGF-1) and connective tissue growth factor (CTGF) in unilateral ureteral obstruction (UUO)rat models during the process of renal interstitial fibrosis caused by unilateral ureteral obstruction (UUO).Methods

4、: The experiment was successfully conducted from May to August, 2007 in Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology. Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: sham operated group，UUO model group, and curcumin-treated

5、group (10 in each group). The rats in the UUO model group and curcumin-treated group underwent UUO surgery. Rats in curcumin-treated group were given water suspension of curcumin powder (200 mg·kg -1·d -1) orally, while those in UUO model group and sham operation group were given water onl

6、y instead. All of the rats were killed in 14 days after surgery. The levels of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (Scr) were measured, histological changes were observed with Masson stain method, and Immunohistochemistry was performed on renal tissue to detect TGF-1 and CTGF. Results: In

7、 the obstructed kidneys，there were significant renal interstieial fibrosis and interstitial space expansion. Immunohistochemical staining showed that the expression of TGF1 and CTGF was significantly increased in the obstructed kidneys. In comparison with the model group，BUN and Scr levels,  in

8、terstitial volume, and the expression of TGF-1 and CTGF in curcumin-treated group were significantly decreased. Conclusions: The results indicate that curcumin can down-regulate the expression of TGF-1 and CTGF in UUO rats, through which curcumin might mitigate the pathological changes of the UUO re

9、nal tissue. It's suggested that curcumin can be used to slow down the progression of chronic renal disease.     Key words ureteral obstruction; fibrosis; curcumin; immunohistochemistry; rats,Sprague-Dawley; renal inerestitum     肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同最终通路，延缓肾间质纤维

10、化的发展，可降低终末期肾病(ESRD)的发生率1。姜黄素是姜黄中提取的一种植物多酚，也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分。近年来的研究不仅证明了姜黄的传统作用，而且还揭示出一些新的药理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人类免疫缺陷病毒、保护肝脏和肾脏、抗纤维化以及防癌抗癌等作用，而且无明显的毒副作用2。2007年58月研究了姜黄素抑制肾间质纤维化的作用机制，其中重在研究姜黄素对在单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠中肾间质中转化生长因子1（transforming growth factor-1,TGF-1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，C

11、TGF）的影响，希望在临床上研制出有效药物。     1  材料与方法     1.1  材料     雄性、无特定病原体动物级（specific pathogen free, SPF）、Sprague-Dawley大鼠同济医学院动物中心提供，生产许可证：SCXK（鄂）2004-002830只，7 w龄，体重(180.2±8.35)g。动物房饲养环境为每笼6只，每24 h换1次垫料，喂以正常饮食，自由进水，温度为（24±2），相对湿度为（45±3）%。姜黄

12、素纯度为95%（美国Sigma公司）；兔抗大鼠 TGF-1、CTGF 多克隆抗体及SP免疫试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。     1.2  方法     1.2.1  造模  适应性饲养1周后，按照完全随机设计方法，以体重由轻到重的顺序编号用随机排列表法分为假手术组、模型组、姜黄素组各10只。假手术组和模型组每天给予蒸馏水2 ml灌胃，姜黄素组将姜黄素粉末（200 mg·kg-1·d-1）混悬于2 ml蒸馏水中灌胃，术前1 d开始给药。造模方法：模型组和姜黄素组行右侧输尿管结

13、扎术，质量浓度为20 g/L戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行正中竖切口打开腹腔，分离右侧输尿管并行双结扎，假手术组只分离但不结扎。于术后第14天处死所有大鼠，处死前下腔静脉取血3 ml做血生物化学检验并行肾原位灌流去除血细胞。取右侧肾脏，纵切为两部分，一部分用体积分数为4%的多聚甲醛溶液浸泡24 h做病理及免疫组织化学检测，另一部分速冻于-70 冰箱。    1.2.2  BUN、Scr检测  采用自动生化分析仪(Beckman CX3 Delta)进行BUN、Scr的检测。     1.

14、2.3  免疫组织化学检查  SP法检测肾组织中的TGF-1、CTGF表达，按SP试剂盒说明书进行。每张切片不含肾小球的肾小管间质区域，随机选取8个高倍镜视野（400倍），用免疫组织化学分析软件系统HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（同济医学院清屏影像公司）对所选视野内的棕黄色阳性信号进行图像分析，计算各组大鼠肾组织TGF-1、CTGF的平均阳性表达率，即棕黄色阳性信号占整个视野的百分比。     1.2.4  肾组织病理检查  右侧肾组织行Masson染色，光镜观察肾间质纤维化情况。间质纤维化定量分析也借助H

15、MIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，取Masson 染色切片，每张切片观察8个不含肾小球，互不重叠的间质高倍镜视野（400倍），计算每张切片肾间质绿染面积占整个视野的百分比。     1.3  统计学方法     采用SPSS13.0统计软件处理数据，计量数据采用(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析和两两比较用q检验，P0.05为差异具有统计学意义。     2  结果     2.1  血生化检查  

16、0;  模型组和假手术组比较BUN、Scr都显著升高（P0.01），姜黄素组和模型组比较，BUN、Scr都显著降低（P0.01）。见表1。     2. 2  免疫组化TGF1、CTGF的表达     模型组与假手术组比较，TGF1、CTGF的表达都显著上调（P0.01），而姜黄素组与模型组比较都显著抑制了其表达（P0.01）。见表1、图1和图2。     2.3  肾组织病理改变     模型组中肾间质增宽，可见间质细胞增多，胶原成分增加，出现

17、明显的纤维化。模型组与假手术组比较，P0.01；姜黄素组与模型组比较，肾间质的胶原成分显著减少（P0.05）。见表1和图3。表1  各组BUN、Scr、TGF-1、CTGF及Masson染色面积比的改变情况(1)与假手术组比较P0.01；(2)与模型组比较P0.01， (3)P0.05     3  讨论     肾小管间质病变程度决定了10年肾脏存活率，比肾小球病变的严重程度更为重要3。延缓肾间质纤维化的进展,可降低ESRD的发生率。UUO是一个成熟的肾纤维化实验模型，其特点是进行性小管萎缩及间质纤维化，早期肾小

18、球相对不受影响，但最终导致整个肾脏结构的破坏4。在梗阻肾的小管间质中细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的产生增加和（或）降解减少均可导致ECM异常积聚，在肾间质纤维化发生和发展具有重要的意义。TGF-1在UUO模型肾脏纤维化的作用已被公认，TGF-1的下调能有效延缓纤维化的进展5。CTGF 除可促进肾小球硬化外,与肾小管-间质纤维化的发生和发展也有十分密切的关系，同时CTGF 是TGF-1介导的肾间质纤维化的重要下游效应因子6。     近年研究表明姜黄素能够促进大鼠系膜细胞凋亡并抑制氧化低密度脂蛋白（oxidation of low

19、 density lipoprotein，OX-LDL）的促增殖作用，显著诱导FAP-1 和bag-1表达7。还可抑制糖尿病大鼠肾脏NF-B p65的核转导从而改善肾脏病理变化8。Kuwabara N等9发现在UUO模型大鼠14 d时姜黄素可以抑制核转录因子-B的活性，对激活蛋白-1却没有明显的作用。本研究重在观察姜黄素对UUO模型大鼠中的TGF-1、CTGF的影响，结果证明了实验前的假想：即姜黄素可以下调梗阻性肾病中TGF-1、CTGF的表达，还同时降低了BUN、Scr，抑制了肾间质的纤维化。     总之，本研究结果提示姜黄素能够改善UUO模型病理损伤，从而达

20、到其对肾间质纤维化的阻抑作用。由于姜黄素具有价格便宜、不良反应小等特点，因而它对于延缓慢性肾脏疾病向终末期肾病的发展是一种很有前途的药物。 【参考文献】  1 EL Nahas AM. Pathways to renal fibrosisJ.Exp Nephrol, 1995（2）:71-75. 2 鲍华英，陈荣华.姜黄素的研究进展J.国外医学儿科学分册,2003(5):254-256. 3 Alexopoulos E,Papagianni A.Papadimitriou M.Is membranous nephropathy only a glomerular diseaseJ.Renal Failure, 1998（1）:1-6. 4 Gerth J H, Kriegsmann J, Trinh TT, et al. Induction of p27KIPI after unilate ral ureteral obstruction is independent of angiotensin J. Kidney Int , 2002(1)