发酵罐中生产纳豆激酶的条件与动力学研究_图文

1、发酵罐中生产纳豆激酶的条件与动力学研究3沙维1,刘妍妍1,张丽萍1,21(黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆,1633192(黑龙江省农产品加工工程技术研究中心,黑龙江大庆,163319摘要对纳豆杆菌进行了10L 发酵罐分批发酵试验,研究发酵罐装液量、接种量、搅拌桨转速对纳豆激酶发酵的影响,并采用Logistic 方程、Luedking 2Piret 方程、Luedking 2Piret 2like 方程描述了发酵中菌体生长、纳豆激酶生成、基质消耗特性。在装液量5L 、接种量3%、搅拌桨转速400r/m in 条件下,发酵得到纳豆激酶活力4476125I U /mL,分批发酵过程的动力学模

2、型与实验值拟合度较好。关键词纳豆激酶,液态发酵,优化,动力学第一作者:硕士研究生(张丽萍教授为通讯作者。3黑龙江省农垦总局科技计划项目(HNKX I V 206205a ;黑龙江省研究生创新科研项目(YJSCX20092125HLJ 收稿日期:2009-11-15纳豆激酶具有很强的纤溶活性1,可由细菌发酵生产。从已有的研究报道来看,目前国内纳豆激酶研究多集中在菌种筛选及培养条件优化方面,且规模较小,仅限于摇瓶,在发酵罐中进行大规模培养报道尚少。由于摇瓶发酵的条件与发酵罐的发酵条件在一定程度上存在差异,往往存在着“放大效应”2,所以,在摇瓶发酵的基础上有必要对发酵罐的发酵条件做进一步的研究。熊晓

3、辉3以优化后的发酵培养基、发酵条件进行5L 发酵罐发酵放大试验,与摇瓶发酵比较,发酵产酶有所提前,到60h 时酶活最高达到2250I U /mL 。黄俊4研究以317L B i oengineering K LF2000型发酵罐进行发酵,研究发现,菌体浓度和溶氧是影响菌体产酶的重要因素,最终发酵液中纳豆激酶的酶活由摇瓶时的1314I U /mL 提高到在317L发酵罐中的2348I U /mL 。梁淑娃5在摇瓶发酵基础上研究了50L 罐和500L 罐发酵情况,最终酶活最高分别达到2210U /mL 和1934U /mL 。本文在前期摇瓶发酵的基础上,对纳豆激酶10L 发酵罐的液态发酵条件进行优

4、化,并对该菌株进行了发酵动力学研究,建立了菌体生长、底物消耗和产物形成数学模型,为纳豆激酶工业化生产奠定了基础。1材料与方法111菌种纳豆杆菌(B ail subticlsc (natto ,黑龙江八一农垦大学食品学院畜产品实验室选育和保存。112培养基斜面培养基:大豆蛋白胨110g,牛肉膏(总氮13%013g,NaCl015g,葡萄糖011g,琼脂210g,pH 712,加水100mL 。发酵种子培养基:葡萄糖310g,大豆蛋白胨(总氮9%210g,MgS O 4012g,K 2HP O 4011g,KH 2P O 4012g,CaCl 0103g,pH 610,加水100mL 。发酵培养基

5、:可溶性淀粉310g ,酪蛋白013g,KH 2P O 4014g,K 2HP O 4014g,CaCl 20102g,豆粕粉210,pH710,加水100mL 。113主要仪器与设备振荡培养箱(HGCE 2F160哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;全自动发酵罐(G BJS -10镇江东方生物工程设备技术公司;空气压缩机(W -013、1215泉州市新华压缩机械有限公司;全自动小型蒸汽锅炉系列(LDR3(6.91017Z 江心服装机械有限公司。114菌体培养方法11411液体种子培养基制备在250mL 锥形瓶中分装50mL 无菌的种子培养基,接入1环已活化的纳豆激酶斜面菌种,37,180r/m

6、 in 的条件下振荡培养9h,再将一级种子液按质量分数3%接种到装50mL 的种子培养基的250mL 锥形瓶中,继续培养14h,作为二级种子备用。1141210L 全自动发酵罐发酵培养将二级种子液接入10L 全自动发酵罐中,按实验设计进行发酵培养。发酵罐管路经锅炉压力为0114-0120MPa 蒸汽消毒30m in 后,发酵罐罐体110-112MPa 空消30m in,发酵培养基液上罐,110-112MPa 实消30m in,待发酵液冷却为34时,接入液体菌种,进行发酵。发酵罐进气口压力为0125MPa,出气口压力为0105 MPa,空气流量为30L/m in。115纳豆激酶活力的测定方法发酵

7、液经4000r/m in离心30m in,收集上清液,适当稀释后即为粗酶液,取样10L按照中华人民共和国卫生部W S2011(X200695关于“蚓激酶的部颁标准"中"尿激酶琼脂糖-纤维蛋白平板法”测定活力。116菌体生长量的测定取发酵液10mL,6000r/m in离心15m in,用无菌蒸馏水洗2次,80干燥至恒重。117残糖的测定用DNS法6测定。118发酵罐培养条件单因素试验分别研究不同装液量(2、3、4、5、6L、不同接种量(1%、2%、3%、4%、5%、不同搅拌浆转速(200、300、400、500、600r/m in对纳豆激酶酶活力的影响。11910L全自动发

8、酵罐发酵动力学试验按118所述优化后的培养条件进行发酵培养,测定生物量、酶活、残糖量,计算发酵动力学方程。2结果与分析211酶活测定标准曲线以尿激酶为标准品,制作标准曲线。通过S AS912软件对数据进行分析得到标准曲线回归方程为y=219310x2511021,相关系数为019904,作为以下试验中纳豆激酶活性测定的标准曲线。212装液量对纳豆激酶产量的影响将二级种子液按3%接种于分别装有2、3、4、5、6L基础发酵培养基的10L发酵罐中,37,300r/ m in下发酵,取第2天的发酵液测定酶活力,选取产生较大酶活的装液量为最适装液量。发酵生产纳豆激酶的纳豆枯草杆菌为好氧菌,通过调整发酵罐

9、中的装液量来满足菌种对氧气的需要。由图1可知,随着装液量的增加,产酶活性最大值呈现降低趋势,对试验结果用S AS912软件进行统计分析,经过显著性分析(Duncna法,3、4、5L的装液量得到的酶活之间差异不显著,低于2L装液量时得到的酶活有显著的差异。6L装液量对应得到的酶活最低。而2L的装液量虽然在得到的酶活方面较高,但是,由于其设备的利用率过低,不适于工业化生产的经济性要求,综合考虑,选择5L装液量 。图1装液量对产酶的影响(注:图中A、B、C表示在0105水平时,不同装液量所得结果间的差异显著性213接种量对纳豆激酶产量的影响在发酵过程中,微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合

10、成有着重要的影响。因此对于纳豆激酶发酵,适合的接种量才能达到较佳的产率。由图2可知,接种量为3%(质量分数有利于纳豆激酶的生成。接种量过小(1%、2%,在发酵体系中微生物调整期延长,整个发酵周期增加,细胞内部的某些维生素和辅酶会向周围扩散,发酵产物产量低;菌体浓度大(4%、5%,微生物的适应程度增加,生长周期缩短,细胞活性高,产物的产量增加,但是菌体浓度过高,使得菌种繁殖过盛,发酵液黏度大,代谢途径可能偏向生长,营养物质消耗过快,培养基中的营养成分发生明显的改变,有毒物质积累,可能改变菌体的代谢途径,不利于酶产物的合成 。图2不同接种量的溶圈直径(注:图中A、B、C、D、E表示在0105水平时

11、,不同接种量所得结果间的差异显著性214搅拌浆转速的选择将种子液按2%接种于装有4L基础发酵培养基的10L发酵罐中,37,分别以200、300、400、500、600r/m in条件下发酵培养,在第2天制取粗酶液测定酶活力,以确定搅拌浆转速。发酵罐中搅拌桨的转动,可以使空气中的氧有效地溶解,利于好氧菌纳豆枯草杆菌的生长代谢。由图3可知,400r/m in 为适宜搅拌桨转数。 图3不同搅拌桨转数条件下的溶圈直径(注:图中A 、B 、C 、D 、E 表示在0105水平时,不同接种量所得结果间的差异显著性。 215发酵动力学模型的建立215111L 发酵罐中分批发酵的试验结果在1L 发酵罐内,纳豆激

12、酶的发酵过程曲线如图4所示。发酵条件为:搅拌速度400r/m in,通气量3L /m in,培养温度37,装液量5L 。每隔5h 取样,测定其纳豆激酶活力、残糖量、菌体生物量。 图4纳豆激酶发酵进程曲线分析图4可知,在发酵前5h,纳豆激酶发酵菌株处于生长延迟期,此时产酶量及速率较低。10h 之后,菌体进入对数生长期,生长速度逐渐加快,耗糖速率随之迅速上升,45h 时,进入发酵中后期,此时,耗糖速率有所下降,酶产量迅速提高。至菌体衰亡期,菌体浓度减小。耗糖速率减缓,酶产量呈下降趋势。21512菌体生长动力学模型根据纳豆激酶分批发酵特点,选用能很好反映分批发酵动力学中因菌体浓度的增加对自身生长起抑

13、制作用的Logistic 模型,来描述纳豆激酶发酵过程中的菌体生长情况,其形式为:d x d t =u max (1-xx max(1式中:u max -菌体最大比生长速率(h -1;X -菌体浓度(g/L ;X max -稳定期菌体浓度(g/L ;t 生长时间(h 。对其积分后,得到代数形式,并利用DPS 软件对方程用麦夸特法进行单因变量模型参数估计,并将得到的参数值代入生长动力学模型方程,得到菌体生长动力学模型方程:x =1.63431-e 4.5578-0.444t(2由图5拟合的结果可知,菌体生长的试验值与模型的计算值非常吻合,拟合度为019807。因此可以确定Logistic 方程能

14、够很好地描述10L 发酵罐中菌体生长情况。图5菌体生长的试验值与模型计算值的比较21513纳豆激酶形成动力学模型由于发酵产物的生成速率与菌体生长速率之间大致存在3种不同类型的关联,分别是:(1产物生成速率与菌体生长速率耦联;(2产物生成速率与菌体生长速率部分耦联;(3产物生成速率与菌体生长速率无关。采用经验模型Luedeking 2Piret 方程可以全面的描述产物生成速率与菌体生长速率的关系:d p d t =-d xd t+x(3当0,=0时,产物生成速率与菌体生长速率耦联;当0,0时,产物生成速率与菌体生长速率部分耦联;当=0,0时,产物生成速率与菌体生长速率无关。将菌体生长方程代入(3

15、式并积分得到产物随时间变化的函数,利用DPS 软件对方程用麦夸特法进行单因变量模型参数估计,并将各参数值代入函数表达式,即得纳豆激酶形成动力学模型方程:P =698.8621+165.5684ln1.6283+0.0060e0.4444T1.6343+5.98811.6283+0.0060e0.4444t(4式中P -纳豆激酶活力(I U /mL ;a -与菌体生长相关的产物生成系数(u /mL ;-与菌体浓度相关的产物生成系数u /(mg h 。纳豆激酶产物形成动力学模型方程中=18314266,=4510220均不为0,说明纳豆激酶合成与菌体生长的动力学关系属于部分耦联型。图6为纳豆激酶合

16、成的试验值与模型计算值间随时间变化的曲线图,其拟合度为018645。 图6酶活的实验值与模型计算值的比较21514基质消耗动力学模型底物消耗速率取决于菌体生长速率、产物生成速率和底物维持能耗所消耗的速率。因此,底物消耗动力学可采用Luedeking 2Piret 2like 方程模型来描述,即:-d x d t =y d xd t +x(5其中,=1y(6=m (7-d x d t =1Y d pd t (8-d xd t=m x (9式中,Y -产物得率系数,即底物转化为产物的转化率;m -维持细胞结构和生命活动所需能量的细胞维持系数。结合式(5-(9,通过发酵过程中基质的消耗物料衡算,并对

17、整合后的算式积分,可得基质消耗动力学模型方程的代数形式,代入利用DPS 软件对方程用麦夸特法进行单因变量模型参数估计所得到参数,得基质消耗动力学方程:s =2.4610+2.2412×10-12(-0.0060e0.4444t0.9963+0.0037e0.4444t -1-0.0997ln (0.09963+0.0036e0.4444t(10将基质消耗实验值与模型的计算值做比较,结果如图6所示,可以看出,该基质消耗模型能很好地描述发酵过程基质的消耗情况,预测生产发酵过程中残糖的变化,拟合度为018662。图7残糖的实验值与模型计算值的比较3结论实验结果表明,在装液量5L 、接种量3

18、%、搅拌桨400r/m in 条件下发酵酶活为476125I U /mL 。应用优化后发酵条件生产纳豆激酶,并通过Lo 2gistic 模型、Luedking 2Piret 模型和Luedeking 2Piret 2like 模型来描述纳豆激酶的生成,确定纳豆激酶的发酵属于部分生长偶联型。模型可以较好地解释实际发酵中菌体生长、产物合成、底物消耗的动力学规律,可用于进一步设计大型发酵工艺。参考文献1Yoshikatsu M ur ooka,M itsuo Ya m shit 1Traditi onal healthfulfer mented p r oducts of Japan J 1M ic

19、r obi ol B i otechnol,2008,35(8:791-79812赵成建,张定丰,金志华,等1利福霉素B 发酵放大11从摇瓶到15L 发酵罐的发酵放大J 1中国抗生素杂志,2002,27(7:398-34013熊晓辉,梁剑光,熊强1纳豆激酶液体发酵条件的优化J 1食品与发酵工业,2004,30(1:62-6614黄俊1纳豆激酶液体发酵过程的优化以及层析法纯化细胞色素P450B M -3的研究D 1浙江大学,200415梁淑娃,黄晓曼,夏枫耿,等,纳豆激酶液体深层发酵技术的研究J 1现代食品科技,2007,23(6:1-316张龙翔,张庭芳,李令媛1生化实验方法和技术M 1北京:

20、高等教育出版社,1997:l -31Study on Cond iti on s and K i n eti cs of Na ttok i n a se Ferm en t a ti on i n Ferm en torSha W ei1,L iu Yanyan1,Zhang L i p ing1,21(College of Food Science,Heil ongjiang Bayi Agricultural University1Daqing,Heil ongjiang163319,China2(Agri-Food Pr ocessing and Engineering Technol

21、 ogy ResearchCenter of Heil ongjiang Pr ovince,Daqing,Heil ongjiang163319,ChinaABSTRACTThe fer mentati on p r ocess of B acillus natto was studied in a102L batch syste m.The fer mentati on con2 diti ons including volu me of the mediu m,inoculati on quantity and r otati on s peed.Models were p r opos

22、ed with the Lo2 gistic equati on f or gr owth,the Luedking2Piret equati on f or natt okinase p r oducti on and Luedking2Piret2like equati on f or substrate consump ti on.The op ti m ized conditi ons were as f oll ows:liquid volume5L/10L,r otati on s peed400r/m in, 3%inoculu m.Under these conditi ons

23、 the activity of natt okinase was4476.25ur okinase units of each m illiliter br oth and the model has p r ovided a good descri p ti on of B acillus subtilis.Key wordsnatt okinase,liquid fer mentati on,op ti m izati on,kinetic行业动态奇华顿公司推出更具“原汁原味”的鸡肉香精世界领先的香精香料生产商奇华顿公司通过深入开展Taste Essentials T M鸡肉风味研究项目

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