不同粒径神经毒素_纳米粒大鼠鼻腔给药脑药动学研究_图文

1、不同粒径神经毒素 2 纳米粒大鼠鼻腔给药脑药动学研究包 强 , 蔡鑫君 , 李范珠(浙江中医药大学药学院 , 浙江 杭州 310053收稿日期 :2010-02-04, 修回日期 :2010-03-22基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (No 30772793, 30371781 ; 浙江省卫生高层次创新人才培养工程资助项目作者简介 :包 强 (1984- , 男 , 硕士生 , Tel:0571286613726, E 2mail:tunshu2008;李范珠 (1964- , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 :药物 新剂型与新技术 , 通讯作者 , Tel:05712866

2、33030; E 2mail:lifanzhuzjtc m. net中国图书分类号 :R 2332; R 322. 81; R 452; R 969. 1; R 977. 6;R 996. 3文献标识码 :A 文章编号 :1001-1978(2010 06-0731-05摘要 :目的 制备不同粒径甲基 化 聚 乙 二 醇 (methylated 2polyethyleneglycol,Me 2PEG 修饰的神经毒素 2 (neur ot oxin, NT 2 聚乳酸 (polylactic acid, P LA 纳米粒 (NT 2 2MePEG 2P LA 2NP, NT 2 2NP , 并考

3、察不同粒径 NT 2 2NP 大鼠鼻腔给药后脑药动学特征 。 方法 以聚乙二醇单甲醚聚乳酸共聚 物 (M ePEG 2P LA 为纳米材料 , 采用复乳 -NT 2 2NP 。 以尾静脉注射 NT 径 NT 2 2NP , NT 2 在 大 鼠 中 脑 导 水 管 围 灰 质 (periaqueductal gray, P AG 部位浓度的经时变化 。 结果 不同粒径的 NT 2 2NP呈圆形或类圆形 , 大小均匀 。大鼠鼻腔给药后小于 100n m 的 NT 2 2NP 的 AUC (02t 分别是 100200、 200300和大于300n m NT 2 2NP 的 1122、 1134、

4、 1160倍 (P <0105 , 表明粒径小于 100n m 时 NT 2 在脑靶部位的浓度明显高于其他粒 径的纳米粒 。 结论 纳米粒的粒径对 NT 2 的脑内递送有 着较为明显的影响 , 粒径小于 100n m 的 NT 2 2NP 可以明显 增加 NT 2 的脑内浓度 , 这一结果为研究适宜粒径的 NP 用 于蛋白多肽类大分子药物入脑奠定了基础 。关键词 :神经毒素 ; 甲基化聚乙二醇 ; 粒径 ; 纳米粒 ; 大鼠 ; 鼻 腔给药 ; 微透析 ; 脑药动学 神经毒素 2 (neur ot oxin, NT 2 是从云南眼镜 蛇毒液中分离得到的一种短链神经毒素的主要成分 , 分子

5、量约为 6700u, 是一种水溶性碱性多肽 , 其 理化性质相对稳定 1。 NT 2 具有良好的镇痛作 用 , 药理研究已表明2, 3其作用部位为中枢神经系统 , 临床上主要以肌内注射方式用于控制各种疼痛 及戒毒治疗 , 属于非麻醉性神经抑制剂4。但是NT 2 分子量相对较大和大多数水溶性大分子多肽类药物相似 , 不易透过血脑屏障 (bl ood brain barrier,BBB 进入大脑 , 需要经过一个较长时间的给药过程 才能在中枢靶部位蓄积到有效的治疗浓度 , 故起效缓慢 , 5。鼻腔给药 (in 2tranasal adm I BBB 能力低的中枢性大分子极性 药物 。 采用生物降解

6、型高分子材料将蛋白多肽类药 物制成纳米粒 (nanoparticle, NP , 可有效保护肽类 药物的活性 , 并能实现缓释 、 控释和靶向释药目 的 7。 本研究 以聚 乙二醇 单甲 醚聚 乳 酸 共 聚 物 (MePEG 2P LA 为载体材料 , 采用复乳 -溶剂蒸发法 制备不同粒径的 NT 2 2NP 。采用微透析取样技术 结合荧光分光光度法测定脑靶部位药物的浓度 , 探 讨不同粒径 NT 2 2NP 大鼠鼻腔给药后脑药动学特 征 。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 药品与试剂 神经毒素 2 (中国科学院昆 明动物研究所 , 质量分数 >99%, 批号 0605

7、30 ; 异 硫氰酸荧光素神经毒素 (F I T C 2NT 2 , 杭州中泰生物 技术有限公司标记 , 批号 CH 205200301 ; 聚乙二醇 单甲醚聚乳酸共聚物 (山东岱罡生物科技有限公 司 , 批号 070601 ; 泊洛沙姆 188(德国 BASF 公司 , 批号 W PT B649C ; 右旋糖苷 270(美国 Sig ma 公司 , 批号 1720280201 ; 人工脑脊液 (自制 :145mmol L-1NaCl, 317mmol L-1KCl, 110mmol L-1MgCl 2, 112mmol L -1CaCl 2, 10mmol L -1NaH 2CO 3, 01

8、1mmol L -1抗坏血酸 , pH 714 ; 其余试剂均为国产分析纯 。1. 1. 2 仪器与设备 超速离心机 (美国 Beck man 公司 ; 超声波细胞粉碎机 (中国宁波新芝生物科技 股份有限公司 ; 小型冷冻干燥机 (美国 Labconco 公 司 ; 激光粒度测定仪 /Zeta 电位仪 (美国 N icomp 公司 ;Modulus T M单管型多功能光度计 (美国 Turner B i 2osyste m s 公司 ; 荧光分光光度计 (日本岛津公司 ; 大鼠鼻黏膜给药装置 (专利号 :20052001352515 ; 微透析脑立体定位架及实验装置系统 (美国 BAS 公13

9、7 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6 :7315司 。1. 1. 3 实验动物 清洁级 S D 大鼠 , 兼用 , 体 重约 300g, 由浙江中医药大学实验动物中心提供 (合格证号 :SCXK 沪 200720005 。 所有动物实验均 按照浙江大学动物饲养和使用指南进行 。1. 2 方法1. 2. 1 4组不同粒径的 NT 2 2NP 制备 称取 40 mg MePEG 2P LA 溶于 110m l 乙酸乙酯中 , 精密加入 40l 的 F I TC 2NT 2 (1g L -1 水溶液 , 涡旋乳化 40

10、s, 再加入 2m l 泊洛沙姆 188水溶液 (或右旋糖 苷 270 , 冰浴下探头超声乳化 30s, 将制得的复乳转 移至 013%P VA 水溶液 100m l 中 , 旋转蒸发 30m in 除去有机溶剂 , 超速离心 (30000r m in -1 30m in, 并用蒸馏水洗涤 3次 , 沉淀冻干后即得 2。 1. 2. 2 形态 取 4液适量 , , 室温 。 1. 2. 3 粒径和 电位 取 4组不同粒径的 NT 2 2 NP 胶体溶液适量 , 用激光粒度仪测定其粒径 、 多分 散系数 (P 1I 及 电位 。1. 2. 4 包封率和载药量 NT 2 的投料量计为 C 0, 取

11、离心后的上清液测定浓度计为 C1, 计算包封率 (C 0-C 1 /C0×100%;NT 2 2NP 的浓度计为 M (NT 2 2NP 冻干后的质量与胶体溶液的体积比即为 M , 计算载药量 (C 0-C 1 /M ×100%。1. 2. 5 溶液配制 F I TC 2NT 2 溶液 :称取一定量的 F I TC 2NT 2 溶液 , 置于 2m l 的容量瓶中 , 加人工脑 脊液溶解并定容至刻度 , 得到浓度为 1g L -1的 F I TC 2NT 2 人工脑脊液溶液对照品 。 F I TC 2NT 2 2NP 溶液 :取按“ 11211” 项下得到的 NT 2 2N

12、P 适量 , 置于 100m l 的容量瓶中 , 均匀分散 在人工脑脊液胶体溶液中既得 。1. 2. 6 标准曲线 精密量取 F I TC 2NT 2 溶液适 量 , 置 1m l 容量瓶中用人工脑脊液定容 , 准确稀释 至浓度为 015、 5、 25、 50、 75、 100g L -1标准系列溶液 。 以人工脑脊液为空白 , 在激发波长 ex=488 n m , 发射波长 em =520nm 下进行荧光测定 , 以荧 光强度 F 对药物浓度 (g L -1 进行线性回归 , 得到回归方程 。1. 2. 7 大鼠脑微透析手术操作 S D 大鼠水合氯醛 (300mg kg -1 i p 麻醉

13、, 俯卧位固定于脑立体定位 仪上 。 颅顶皮肤消毒后矢状切开大鼠头部正中皮 肤 , 暴露颅骨 。 用牙科高速钻机在颅骨上钻开一直 径约 015mm 的小孔 。 将微透析探针插入脑骨表面 下 614mm (即左侧 P AG 部位 , 用牙托粉和螺钉将 微透析底座固定在颅骨上 , 缝合皮肤 。1. 2. 8 微透析探针在体回收率测定 8 运用反透 析法测定 NT 2 微透析脑探针的在体回收率 。按 “ 11217” 项下操作 , 微透析脑探针埋植手术结束后 , 使用浓度分别为 10、 50和 100g L -1的 F I T C 2NT 溶液灌流 , 流速为 2l m in -1, 每 30m i

14、n 收集 1次 透析液 , 收集 3h 。 采用单管型多功能光度计测定透析液中对照品 浓度 , 根据公式 回收率 /%=C -CC per×100%计 (C C 、 灌流液 中 F I 取 S D 大鼠 5组 , 每组 5只 :NP 2 尾静脉注射 NP(iv 、 NP 2 鼻腔给药组 NP 2 (in 、 NP 2 鼻腔给药组 NP2 (in 、 NP 2 鼻腔给药组 NP2 (in 、 NP 2鼻 腔 给 药 组 NP 2 (in 。按 “ 11217” 项下进行手术 , 探针透析膜埋植手术结束 后灌流人工脑脊液 , 流速 2l m in -1, 平衡 30m in 。 采用大鼠

15、鼻腔给药装置给药 , 剂量相当于 60g kg -1的 NT 2 , 同时使用自动恒温冷冻收集器收集 透析液 , 间隔 30m in, 收集 480m in 。透析液测定其 荧光强度 , 并折算成 NT 浓度 。 通过 NT 2 在体回收 率校正 , 得到各时间点的脑内 NT 2 实际浓度 。 1. 2. 10 数据处理与药动学参数的计算 使用非隔 室模型方法处理数据 , 计算相关药代动力学参数 , C max 、 T max 为实测值 , AUC (02t 采用梯形法计算 。用 O ringin610软件进行方差分析及配对 t 检验 , 药物动 力学参数见 Tab 2。2 结果2. 1 NT

16、 2 2NP 形态 不同粒径的 NT 2 2NP 外观 为乳白色胶体溶液 , 电镜下呈圆球形 , 大小均匀 。 2. 2 NT 2 2NP 的粒径 、 电位 、 包封率和载药量 用复乳 -溶剂挥发法制备的不同粒 NT 2 2NP 的粒 径 、 电位 、 包封率和载药量见 Tab 1。2. 3 透析样品测定的标准曲线 结果表明 , F I T C 2 NT 2 在 015100g L -1范围内与荧光强度呈良 好的线性关系 , 回归方程 F =751704+51802(n = 6, r =019995 。2. 4 F I TC 2NT 2 微透析探针在体回收率 I T C 2 NT 2 微透析探

17、针在 P AG 部位的在体平均回收率为 (1511±111 %。 该回收率用于透析部位药物实际 浓度的校正 。2. 5 NT 2 2NP 的药时曲线与药动学参数 大鼠 脑微透析实验过程示意图见 Fig 1。 4组不同粒径237 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6Tab 1 Parti cle si ze, P . I , electr i c poten ti a l, en trap m en t eff i c i ency and load i n g capac ity of NT 2 2NP (

18、 x ±s, n =5 Particle size /nmP . I Electric potential/mVEntrapment efficiency/%Loading capacity/%NP 2 70. 4±8. 60. 126±0. 05-9. 94±1. 5381. 14±2. 950. 34±0. 10NP 2 127. 8±12. 30. 166±0. 06-14. 91±1. 3181. 50±2. 350. 42±0. 11NP 2 266. 8±10.

19、50. 080±0. 03-12. 87±1. 0883. 38±3. 220. 29±0. 12NP 2322. 5±8. 90. 034±0. 02-21. 36±1. 3683. 73±3. 430. 35±0. 08Tab 2 The phar macok i n eti ca l param eters i n PAG after i n trana s a l ad m i n istra ti on of four NT 2 2NP ( x ±s, n =5Para meterNP

20、 2 NP 2 NP 2 NP 2 NP (iv C max /g L -124. 89±1. 56321. 64±0. 7718. 25±0. 8116. 37±1. 8814. 95±1. 90T max /h1. 78±0. 081. 80±0. 121. 97±0. 052. 01±0. 092. 41±0. 16MRT/h3. 32±0. 143. 59±0. 093. 62±0. 163. 71±0. 153. 98±0. 16AUC

21、 /g h L-1103. 69±9. 7894. 45±9. 0989. 59±72. 26±15. 77 3P <0105vs NP 2 , NP 2 , NP 2 ; P <0105vs NP 2 , NP 2 , NP 2 .NT 2 2NP 大鼠鼻腔给药后的药时曲线见 2动学参数见 Tab 2(iv 相比 , 4组 不 同 粒 径 2腔 给 的 AUC (0-t 、 C max P <0105 。 NP 2 的 AUC (0- 、 C max 均高于 NP 2 、 NP 2 和 NP 2 , 而 T max 均小于其他 3组

22、(P <0105 。F i g 1 Sche ma ti c d i a gram of ra t bra i n m i crod i a lysisF i g 2 The prof iles of m ean drug PAG concen tra ti on 2ti m e afteri n trana s a l ad m i n istra ti on of four NT 2 2NP (n =53 讨论 根据文献和前期研究 8, 9发现 , 复乳 -溶剂挥发法制备 NT 2 2NP 时 , 乳化剂的种类与浓度 、 超声 时间 、 稀释剂的浓度等因素对 NT 2 2NP 粒径大

23、小 都有影响 , 本实验通过改变乳化剂的种类 (泊洛沙 糖 苷 270 和 浓 度 (泊 洛 沙 姆 188214%和 115%, 右旋糖苷 270, 016%和 115% 、 超 声时间 (30s 、 18s 、 15s 、 9s , 制备 4组不同粒径的 NT 2 2NP, 记做 :NP 2 、 NP 2 、 NP 2 、 NP 2 。 在中枢神经系统中从 P AG 到脊髓的下行抑制 通路是比较肯定的与阵痛有关 , 即中脑 P AG 与中枢阵痛部位有着密切的联系 10。 P AG 对痛觉有高度 选择性抑制性作用 , 可调节 G ABA 、 谷氨酸等神经递 质的释放11, 12。所以 , 本

24、实验中透析液采集选择P AG 部位 。 鼻腔给药是一种实现多肽类药物脑内递药的有 效方法之一 , 纳米粒作为多肽类药物的载体 , 粒径是影响其入脑的重要因素之一 13。从 Tab 2可知 ,在给药 剂 量 相 同 的 前 提 下 , 4组 鼻 腔 给 药 组 的 AUC (0-t 和 C max 分别为 (127101±12132 g h L -1和 (24189±1156 g L -1, (103169±9178 g h L -1和 (21164±0177 g L -1, (94145±9109 g h L -1和 (18125±0

25、181 g L -1, (89159±10174 g h L -1和 (16137±1188 g L-1, 各 组 不 同 粒 径 NT 2 2NP 经 鼻 腔 给 药 后 的AUC (0-t 为静脉注射组 NP (iv 的 117、 115、 112、 111倍 (P <0101 , C max 为 NP (iv 组的 116、 115、 113、 111倍 , 说明 NT 2 2NP 经鼻腔给药后药物脑内递送的 程度和速度均优于静脉注射 。 可能的原因是由于鼻 腔和颅腔在解剖和生理上的独特联系 , 药物可能绕过 BBB 经嗅区鼻 -脑通路直接进入脑内 14, 因此

26、 脑内药物浓度可能高于其它给药途径 。 鼻腔黏膜上皮只有一层纤毛柱状上皮细胞构成 , 而且上皮细胞下存在着丰富的毛细血管和毛细 淋巴管 。 鼻腔给药后 , 少部分药物经过嗅神经通路 和嗅黏膜上皮通路直接进入大脑 , 但大多数药物被 呼吸道黏膜吸收进入血液循环 , 进而透过血脑屏障337 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6进入脑 组 织 15。有 研 究 认 为 16NP 可 能 是 通 过BBB 表面内皮细胞的胞转作用进入大脑 , 而且较小 粒径的 NP 越容易透过 BBB 上的血管内皮细胞 。 本 实验 中 ,

27、与 NP 2 、 NP 2 、 NP 2相 比 , NP 2的 AUC (0- 分别为其它 3组的 1122、 1134、 1160倍 (P <0105 , C max 分别为其它 3组的 112、 113、 115倍 (P <0105 。 说明粒径对 NP 的入脑有着较为明显的 影响 , 粒径小于 100nm 时 NT 2 2NP 可以明显增加NT 2 的脑内浓度 。 Lock man 等 17提出 , 构建理想的入脑 NP 的粒径应小于 100n m 。 Kuo 等 18通过 体外研究发现 , 随 NP 粒径增大 , 其体外 BBB 透过率 降低 。 从药时曲线图及药动学参数可

28、以看出 , 与 NP 2 、 NP 2 、 NP 2 相比 , NP 2 鼻腔给药后脑内浓 度明显增加 , 入脑递送时间相对加快 , 含量增加是否能提高 NT , 与药效学的结合研究 面的研究 。 采用微透析取样技术 19对具有脑靶向性的药 物进行药动学研究 , 透析液中的药物浓度真实的代 表了脑靶部位细胞外液中非结合药物浓度的经时变 化 , 而且取样技术不影响实验动物的正常生理功能 。 本实验以清醒自由活动的大鼠为实验模型 , 运用脑 微透析技术研究了不同粒径 NT 2 2NP 鼻腔给药的 脑内药物动力学过程 。 参考文献 :1 Chen R Z, Robins on S E . The e

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40、eti ca l study of d i fferen t d i a m etersneurotox i n 2 nanoparti cles after i n trana s a l ad m i n istra ti on i n ra tsBAO Q iang, CA I Xin 2jun, L I Fan 2zhu(College of Phar m aceutical Science, Zhejiang U niversity of Traditional Chinese M edicine, Hangzhou 310053, China Abstract:A i m To p

41、 repare NT 2 l oaded nanoparti 2cles with different dia meters modified by Methylated 2437 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6polyethyleneglycol (Me 2PEG and evaluate their brain phar macokinetics after ad m inistered nasally in rats . M ethods NT 2 2NP was p repared by e mulsi

42、 on /s ol 2 vent evaporati on method and MePEG 2P LA was used as the carrier material . M icr odialysis technique and fluo 2 r os pectr ophot ometry were used t o deter m ine NT 2 concentrati on after nasal adm inistrati on in the brain of rats . Results The appearance of allNT 2 2NP gr oup s was r

43、ound or si m ilar . The AUC (0-t of bel ow 100n m NT 2 2NP was 1122f old as that of 100200nm NT 2 2NP, 1134f old as that of 200300nm and 1160 fold as that of exceed 300n m NT 2 2NP (P <0105 treated nasal ad m inistrati on in rats . The quantity and s peed of bel o w 100nm NT 2 2NP was re markably

44、 higher than the other three size NT 2 2NP . Conclu 2 si on s The size of NP has s ome significant influence on drug delivery t o the brain . W hen the dia meter is be 2 l ow 100nm , the NT 2 2NP significantly i m p r oves the NT 2 concentrati on level in brain . The outcomes of this research p r ov

45、ide a feasible path t o devel op suitable dia meter NP f or the adm inistrati on of giant molecule drug such as p r otein and polypep tide .Key words:neur ot oxin 2 ; Methylated 2polyethyleneg 2 lycol; particle dia meter; nanoparticle; rats; intranasal ad m inistrati on; m icr odialysis; brain phar macokinetics丹皮酚对人肝癌 BE L 27402细胞凋亡和 CO X 22、 Surv i v i n 、 X I AP 、 c 2I AP1表达的影响 彭万仁 , 付卫争 , 孙国平 , 范璐璐 , 葛 磊 , 吴志丽(安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科 , 安徽 合肥 230022中国 图 书 分 类 号 :R 284. 1; R 329. 24; R 329. 25; R 735. 702. 2; R 9