人鼻息肉组织及外周血Ｔ淋巴细胞亚群分布的研究

1、人鼻息肉组织及外周血淋巴细胞亚群分布的研究                 【摘要】 目的：研究鼻息肉组织及外周血淋巴细胞亚群分布 ，探讨T细胞介导的免疫反应与鼻息肉形成的关系。方法：采用免疫组化及流式细胞术检测70例鼻息肉患者鼻息肉组织、外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+的表达，并与30位志愿者下鼻甲粘膜、正常人外周血进行比较。结果：鼻息肉组织中可见各种炎细胞浸润，CD4+和CD8+细胞数增多（P<0.05）；其中CD4+细胞明

2、显多于CD8+细胞。CD4/CD8与对照组有显著性差异（P<0.01）。鼻息肉患者外周血中CD4+和CD8+细胞数及CD4+/CD8+比值与对照组有显著性差异。结论：鼻息肉组织和外周血中有大量T淋巴细胞浸润且高度表达CD4细胞，提示鼻息肉的形成与T淋巴细胞亚群免疫失衡有关。 【关键词】 鼻息肉 T淋巴细胞亚群 免疫组织化学 流式细胞术The Expression of T-lymphocyte Subsets in the Nasal Polyps Tissues and Peripheral Blood of HumanAbstract： Objective： To investiga

3、te the infiltration of T lymphocytes in nasal polyp tissues and the peripheral blood, to analyze the roles of the immunity reaction of T-lymphocyte in the formation of Nasal polyp. Method： Nasal polyp tissue samples and peripheral blood were obtained from 70 patients.The inferior turbinate mucosa we

4、re obtained from 30 volunteers and the normal peripheral blood as comparison. The nasal polyp tissue samples and compared group subjects were studied by immunohistochemical method, the peripheral blood was studied by FCM. Result：There were significantly large number of CD4+ and CD8+ cells in nasal p

5、olyp tissue samples （P<0.05）. A significant predominance of CD4+ cells over CD8+ cells was found in the two subgroups tissues samples (subepithelia, arounding glands and blood vessels) of nasal polyp. The ratio of CD4+/CD8+ in the under-epidermic layer and around the blood vessel gland in the nas

6、al polyps tissues samples (1.96±0.18、1.99±0.19)was significant difference compared with that in compared group(1.18±0.15、1.02±0.15) (P<0.01).CD4+,CD8+,CD4+/CD8+ were significant difference in the peripheral blood in Nasal polyps compared with those in compared group .Conclusio

7、n： There were generous of T-lymphocyte infiltrating in nasal polyps.The expression of CD4+in T-lymphocyte was abnormally high,which indicated that the formation of nasal polyp is relevent to the off-balance of the immun提人鼻息肉组织及外周血淋巴细胞亚群分布的研究 ity of T-lymphocyte.Key words: Nasal polyps; T-lymphocyte;

8、 Immunohistochemistry； Follow cytometery1 资料和方法1.1 临床资料：70例鼻息肉标本源自我科2003年10月至2005年12月住院手术的慢性鼻窦炎鼻息肉患者，男38例，女32例；年龄2590岁，平均57岁。其中型1期17例，型2期19例,型3期18例,型16例1。所有患者均经鼻内窥镜、鼻窦CT检查以及术后病理诊断证实。30例对照组鼻粘膜标本源自我科鼻中隔偏曲行鼻中隔成型术患者的下鼻甲。两组患者均无变应性鼻炎、哮喘、阿司匹林特异反应性、支气管扩张、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病等典型病史，近期(2周内)无急性呼吸道感染及类固醇药物应用史。两组患者均用皮

9、内试验法进行了吸入性变应原检测及血液中特异性IgE过筛检测，均为阴性。所有标本均于手术中取材，其中对照组标本为正常下鼻甲粘膜，取下标本迅速放入10中性缓冲福尔马林液中充分固定、石蜡包埋后备检。应用荧光免疫流式细胞术检测鼻息肉患者外周血淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的表达,并与正常人外周血的相应指标进行比较。1.2 试剂： 鼠抗人CD4、CD8单抗购于北京迈新公司，单克隆抗体鼠抗人CD3 FITC 、CD4PE、CD8 PE购于美国BD公司，SP试剂盒购于北京迈新公司。染色方法采用S-P法染色步骤进行免疫组织化学染色。每例标本均同时做HE染色。1.3 检测方法1.3.1 免疫染色步骤：脱蜡、水化

10、组织切片， 3过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶； 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；切片浸入pH6.0枸橼酸缓冲液(800ml/架1500ml/架)中，置微波加热中低档15min，室温冷却20min；滴加10山羊血清30ul，室温孵育20min；倾去血清，滴加适当比例稀释(1：80)的一抗(分别为CD4,CD8)3050ul，4冰箱过夜；PBS冲洗，3min，重复3次；滴加生物素化二抗工作液(SP-9000)30ul,37孵育15min；PBS冲洗，3min,重复3次；滴加链霉素抗生素-过氧化物酶溶液(Streptavidin-peroxidase,SP)50ul，室温孵育15

11、min； PBS冲洗，3min,重复3次；显色剂(DAB)显色：自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。1.3.2 外周血检测：取肝素抗凝后的外周全血100ul, 先加入界定淋巴细胞的单克隆抗体CD3FITC,再分别加入一种待检测的单克隆抗体（CD4PE、CD8PE）20ul,震荡混匀20s,避光,室温孵育30min; 加入溶血素100ul, 震荡混匀20s, 避光,室温下溶血10min,加入双蒸水1000ul, 震荡混匀20s, 避光,室温孵育10min; 加PBS液5000ul，洗涤，1500rpm/min,5min,离心2次，进行FCM检测。1.3.3 流式细胞仪分析：全部数据经FACSc

12、alibur流式细胞仪及CellQuest软件程序获取和分析。流式细胞仪激发光为氩离子激光488谱线。前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)以线性信号收集,所有荧光强度以对数(0104)度量收集。先在FSC SSC的二维散点图中画出淋巴细胞区,然后对淋巴细胞PE和FITC荧光强度检测,其中FITC为荧光1(FL1),滤光片带通为(530±10)nm;PE为荧光2(FL2),滤光片带通为(575±10)nm。每管样品检测5000个细胞。每次检测阳性细胞百分率之前,首先根据相应的同型对照(Isotype)确定统计学分区,即双阴性、双阳性及单阳性区。获得的数据在苹果电脑Power

13、 Macintosh上用CellQuest ( 人鼻息肉组织及外周血淋巴细胞亚群分布的研究(2) 软件程序获取和分析。1.4 统计学分析：应用SAS统计软件对实验组和对照组各数据进行分析，方差齐做t检验，方差不齐做t检验，计算出P值(取P<005为差异有显著性)。2 结 果2.1 HE染色:鼻息肉组织上皮增生变厚，可见鳞状上皮化生，上皮下基质明显水肿，间质为疏松结缔组织，其间可见少量扩张的微血管和腺体，可见有囊状扩张的腺体。组织间有各种炎细胞浸润，其中以淋巴细胞浸润为主，而以嗜酸粒细胞浸润为主的约占32.7。对照组为假复层纤毛柱状上皮，其下为大量微血管和小腺体,也可见散在炎细胞。2.2

14、阳性细胞计数:组织切片于光学显微镜下观察。CD4+或CD8+细胞呈典型深棕色胞膜表达。在高倍显微镜(10×40)下，分别于上皮下和血管腺体周围各选取10个视野，进行阳性细胞计数，取平均值，为每高倍视野平均阳性细胞数。并计算出各组CD4+CD8+细胞数。鼻息肉组织中可见大量CD4+，CD8+细胞,分布特点：其分布呈丛集性，多集中在上皮下和腺体血管周围，而在间质中则呈较均匀散在分布。CD4+细胞数明显多于CD8+细胞数。鼻息肉组织上皮下、腺体血管周围CD4+细胞数(51.46±28.88、41.89±29.98)与对照组CD4+细胞数(19.20±18.44

15、、13.09±14.06)有显著性差异(P<0.01)。鼻息肉组织上皮下、腺体血管周围CD8+细胞数(26.32±19.43、21.04±16.76)与对照组 (16.30±15.73、12.83±12.36)有显著性差异(P<0.05)。 鼻息肉组织上皮下、腺体血管周围CD4+/CD8+细胞数比值(1.96±0.18 1.99±0.19)与对照组 (1.18±0.151.02±0.15)有      显著性差异(P<0.01)。对照组中大部分切片

16、可见CD4+和CD8+细胞,但数量较少,有的切片甚至未见CD4+和CD8+细胞，CD4+和CD8+细胞亦主要集中在腺体血管周围,呈散在分布。CD4+/CD8+比值为1.18±0.15，见表1，2,3。表1 鼻息肉组与对照组上皮下CD4+和CD8+细胞数比较（略）表2 鼻息肉组与对照组血管和腺体周围CD4+和CD8+细胞数比较（略）表3 CD4+和CD8+在鼻息肉患者和正常人外周血中的表达（略）2.3 在鼻息肉患者外周血中CD4+，CD8+细胞数及CD4+/CD8+细胞数比值表达分别为38.90±6.56、29.36±4.96、1.95±0.12与对照组2

17、5.08±4.74、17.48±3.94、1.43±0.13有显著性差异(P<0.01)。对照组中CD4+，CD8+细胞数较少，CD4+/CD8+细胞数比值1.43±0.13。3 讨 论鼻息肉是一种常见病，发病率较高(成人1%2)，复发倾向强(术后复发率15%40)2，在鼻科临床中占有重要地位。因发病机制至今不清，给临床治疗带来很大麻烦。近年来，为了探讨T细胞介导的免疫反应与鼻息肉形成关系，人们进行了大量的研究，并取得了一定的进展。Fokken3采用单克隆抗体技术定量分析了伴或不伴变应性鼻炎的鼻息肉上皮及固有层中浸润的细胞，并设立对照，发现T淋巴细

18、胞远多于淋巴细胞； Morinaka等4的研究发现，在鼻息肉和下鼻甲粘膜的免疫反应中淋巴细胞起主要作用且T淋巴细胞均远多于淋巴细胞，认为T淋巴细胞在鼻粘膜的免疫系统中起中心作用。许多研究证实了T辅助淋巴细胞在鼻息肉中的作用，但是CD4+、CD8+谁占主导，观点不尽相同。Fokken3采用单克隆抗体技术定量分析了伴或不伴变应性鼻炎的鼻息肉上皮及固有层中浸润的细胞，并设立对照，发现T淋巴细胞远多于淋巴细胞，在上皮中CD8+远多于CD4+，在固有层中则几近相等。 Stoop等5也提出上呼吸道粘膜慢性炎症在鼻息肉病因、病理中起重要作用，并指出与T细胞亚群分布失衡有关，在他的研究中指出鼻息肉组织中的CD

19、8+细胞明显多于CD4+细胞，所以抑制和降低了局部免疫反应性，改变了T细胞介导的免疫防御过程。台湾学者Liu等6的实验中得出了相似的结果，他同时指出；变态反应可能不是鼻息肉形成的原因，T细胞介导的免疫反应则与息肉形成关系密切。Larocca等7和Hamilos等8的研究中却发现CD4+细胞增多，指出在鼻息肉免疫中，由于激活了T-辅助细胞，使一系列细胞因子释放，最终导致鼻息肉的形成，说明在鼻息肉组织中免疫反应性呈活化和扩大状态。Leprini9等人对鼻息肉组织中的淋巴细胞亚群的研究得出了相似的结果。本实验结果显示CD4+，CD8+细胞在鼻息肉组织中表达明显增多，多集中在上皮下和腺体血管周围,且C

20、D4+明显多于CD8+细胞。CD4+细胞数，CD8+细胞数及CD4+/CD8+与对照组比较均有显著性差异。与Larocca7，Leprini8等及国内秦永等10、袁晓培等11作者对鼻息肉组织中的淋巴细胞亚群的研究结果一致，袁晓培等认为CD3CD4+，CD3CD8+细胞在鼻息肉组织中表达明显增多，且CD4+明显多于CD8+细胞，CD4+/CD8+>1，并指出CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+细胞的分布呈丛集性,多集中在上皮下和腺体血管周围,说明在鼻息肉上皮和腺体血管的典型病理改变过程中,辅助细胞同样发挥着重要的作用。Bellion等12使用单克隆抗体技术研究了4例鼻息肉患者息肉组织中的

21、CD8、CD4、CD3、Anti-HLADR及CD25、CD11、CD24的分布,主要观察了血管周围及息肉与周围组织交界处,发现肥大细胞膜上表达有IL-2R并邻近细胞而存在。细胞亚群多为4+,占75%,多成团或簇状分布于粘膜下及连结部,几乎所有的细胞均处于活化状态下。由此认为T细胞介导的细胞免疫在鼻息肉的形成中起重要作用，且4+占主导。我们知道CD4+分子增强对MHC类抗原的结合能力，CD8+分子则增强对MHC-I类抗原的结合能力；这两个亚群代表不同的免疫应答反应：CD8+主要表现为杀伤作用，CD4+则通过分泌淋巴因子，增加和扩大免疫应答过程。近年来有关鼻息肉发病中细胞因子作用的研究证实，有多

22、种相关的重要细胞因子在鼻息肉组织过度表达，它们主要来源于CD4+T细胞，可调节多种细胞的生理功能，常参与炎症和免疫反应。并且诸多实验已证实细胞因子在鼻息肉的局部微环境中起着重要的作用，在鼻息肉的形成和发病中起着重要的作用。例如Min等13研究发现，在感染性和变应性鼻炎导致的鼻息肉组织中IL-4、IL-5和INF-mRNA高表达；Ohno等14发现鼻息肉组织中可检测出GM-CSFmRNA，而在正常下鼻甲粘膜中没有； Bachert等15提出IL-5在变应性鼻息肉和非变应性鼻息肉中均高表达，二者无显著性差异，且695的IL-5阳性细胞为嗜酸性粒细胞，但嗜酸性粒细胞并非IL5的唯一来源，T细胞，肥大

23、细胞等是IL5的主要来源。综上所述，当鼻腔局部受到致病原的刺激，T辅助细胞是免疫应答中核心淋巴细胞，通过抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)的加工处理，使T辅助细胞得以识别和活化，CD4+细胞增多，释放多种相关细胞因子，使各种炎细胞聚集、增殖和激活，发挥局部抗炎作用，但由于抗原作用的持久性，使局部炎症反应长期存在，呈慢性改变，在发挥抗炎作用的同时又造成了组织的损伤和演变，最终导致鼻息肉的形成。本实验外周血CD4+，CD8+细胞检测结果与鼻息肉组织中的结果一致，因此提示，全身血液循环中的T淋巴细胞可能因为鼻息肉局部的相关因素导致CD4+的表达显著增高。史等16采用流

24、式细胞仪术检测鼻息肉组织、外周血中T淋巴细胞CD3、CD69的表达，发现鼻息肉组织中有大量T淋巴细胞浸润，且为活化的T淋巴细胞。陈嵘等17采用流式细胞术检测鼻息肉患者鼻息肉组织,外周血中T淋巴细胞IFN-r,IL-4的分泌情况,结果显示鼻息肉组织中有大量T淋巴细胞浸润，与病人外周血相比,鼻息肉组织T淋巴细胞IL-4的表达增多,而IFN-r的表达减少，病人外周血中IL-4, IFN-r的含量均显著高于正常人。从而得出结论:鼻息肉患者鼻粘膜局部免疫异常,Th细胞因子分泌优势发生改变,造成鼻腔粘膜“微环境”改变,可能与鼻息肉的形成有密切关系。本研究既从组织方面同时又从外周血的角度进一步阐明了T细胞介

25、导的免疫反应与息肉形成关系密切，T淋巴细胞免疫失衡，增加和扩大免疫应答过程，使各种炎细胞聚集、增殖，最终导致鼻息肉的形成这一过程。【参考文献】中华医学会耳鼻咽喉科分会, 中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会.慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准（1997年，海口）. 中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:134.Bachert C,Gevaert P,Holtappels G,et al.Nasal polypsis:from cytokines to growth.Am Rhinol,2000,14:279-290Fokken WJ ,Holm AF,Rijntjes E,et a

26、l. characterization and quantification of cellular in filtrates innasal mucosa of patients with grasspollen allergy,nonallergic patients with nasal polyps and controls. Int-Arch allergy-AppLImmu ( 人鼻息肉组织及外周血淋巴细胞亚群分布的研究(4) ) nol,1990，93: 66-72.4Morinaka S,Nakamura H.Inflammatory cells in nasal mucosa

27、 and nasal polypsJ.Auris Nasus Larynx,2000,27(1):59-64.5Stoop AE, van der Heijden HA, Biewenga J, et al.Lymphocytes and nonlymphoid cells in human nasal polypsJ Allergy Clin Immunol, 1991, 87: 470-475.Liu C M,Shun C T,Hsu M.Lymphocyte subsets and antigenspecific IgE antibody in nasal polyps.Ann Alle

28、rgy,1994,72:19-247Larocca LM, Maggiano            N, Capelli A, et al.Immunopathology of nasal polyps:an immunohistochemical approch. Ann Allergy, 1989, 63: 508-512.8Hamilos DL, Leung DY, Wood R, et al. Chronic hyperplastic sinusitis: assoc

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