westernblot实验步骤

1、Western bolt一、实验目的通过实验了解 western blot 技术的原理和操作。二、实验原理SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式, 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。PAGE 能有效的分离蛋白质 , 主要依据其分子量和电荷的差异 , 而 SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关， 因此 SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关

2、， 在达到饱和的状态下， 每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在 15KD到 200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，式中： MW为分子量， X 为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳， 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。硝酸纤维素膜 (nitrocellulose filter membrane，简称 NC膜) ，在胶体金试纸中用做 C/T 线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。 NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。第一抗体就

3、是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。化学发光 HRP 底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为 ECL 试剂）是目前 Western blot检测中最为灵敏的试剂。 显影液的 A 液主要成分为鲁米诺（ Luminol ）及发光增强剂， B 液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有 HRP（辣根过氧化物酶），可以催化 A 液和 B 液反应发光。三、实验器材1.电泳槽，胶板架子2.转膜仪3.NC 膜4.电泳电源5.滤纸6.摇床7.X 射线摄影暗匣8.X 射线胶片9.塑料薄膜四、实验试剂1.runningbuffer5xrunn

4、ingbuffer(1L)Tris15.1gGlycine94.0gSDS5.0gddH2O定容至 1L使用前稀释 5 倍2.Transfer buffer10×Transfer buffer(1L)Tris30.3gGlycine144.0gddH2O定容至 1L使用前稀释 10 倍，加入 1/4 体积的甲醇3.TBS10×TBS(500mL)Tris12.1gNacl40.0gddH2O定容至 500mL用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.64.TBST(1L)1×TBS:Tween-20=1000:1ddH2O定容至 1L5.5%的脱脂奶粉溶液 (50m

5、l)脱脂奶粉2.5gTBST定容至 50ml6. 一抗溶液7. 二抗溶液8. 显影液现配现用，溶液 A：溶液 B=1:1 配置。9.SDS-PAGE（配方见下一页）五、操作步骤1.SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1SDS-PAGE胶的配置先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。准备好试剂。计算所需要使用试剂的量。例： 6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要 7ml，10 块胶，共需要 70ml 将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有正反之分，上面的“ up”朝上。准备配胶按照上面配方依次添加。注意： 1. 添加量少的试剂要注意混匀2.TEMED，APS要最后加配好

6、分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。分离胶加入后， 用异丙醇或水封平胶面， 注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。半小时后观察分离胶是否凝结， 左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。 凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约 3ml。注意不要到过多的浓缩胶， 以防插梳子后胶会溢出， 倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。A.分离胶6%GEL5ml7ml8ml10ml

7、H2O2.853.994.565.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl （ pH8.8 ） 1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0040.00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-HCl （ pH8.8 ） 1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0

8、030.00420.00480.00610%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.353.293.764.740%Acr/bis1.251.7522.51.5Mtris-HCl （ pH8.8 ） 1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00412%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.12.943.363.340%Acr/bis1.52.12.44.01.5Mtris-HCl （ pH8.8 ） 1.31.822.082.510%SDS0.050.070

9、.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00415%GEL5ml7ml8ml10mlH2O1.7252.4152.763.4540%Acr/bis1.8752.62533.751.5Mtris-HCl （ pH8.8 ） 1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP （过硫酸铵）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.004B.浓缩胶5%GEL2.02ml4.04ml6ml10mlH2O1.482.964.443.440%Acr/bis0.250.

10、500.750.831.0Mtris-HCl （ pH6.8 ） 0.250.500.750.6310%SDS0.020.040.060.0510%AP （过硫酸铵）0.020.040.060.05TEMED0.0020.0040.0060.0051.2凝胶电泳将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净， 把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。注意：胶板较短的一侧朝内。往电泳槽内注入 running buffer，如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将 running buffer 加超过上样孔，但也不要漫过胶板最上方。根据自己需求上样。盖上电泳槽的盖子， 注意电极的正负。 插上电源，打开电

11、源，设置时间和电压。一般需要设置两次时间， 浓缩胶 100v，0.5h；分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。分离胶浓度越低，蛋白样跑的越快。开始电泳。2. 转膜（半干转） 转一张膜需准备2 张比分离胶部分略大的滤纸和1 张与滤纸相同大小的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。在转膜前要将 NC 膜先放在去离子水中浸泡几分钟，因为直接将 NC 膜泡在 Transferring buffer中会导致 NC膜变的很皱。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这

12、样会阻止膜吸水。） 在加有 Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。 将转膜仪打开， 在上面垫浸泡过的滤纸， 用试管取一些Transferringbuffer25v，45min。轻轻倒在上面，再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。 在滤纸上摆放好 NC 膜,注意膜的中间先与滤纸接触，然后两边慢慢放下。将玻璃板撬掉才可剥胶， 撬的时候动作要轻， 要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后， 将浓缩胶轻轻刮去 （浓缩胶影响操作） ，要避免把分离胶刮破。记住正反面，切去一角已标

13、记方向。小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶，后用手拿着胶的轻轻置于 NC 膜上，注意胶的中间要先与 NC 膜接触，然后慢慢放下，以防有气泡。用手调整使其与 NC 膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。在最上面铺上最后一层滤纸。用纸吸取多余的 Transferring buffer 。盖上转膜仪的盖子，插上电源，打开电源，设置时间和电压，3. 免疫反应1.取出 NC 膜于，用剪刀减去多余的 NC 膜部分，用同样的方法剪去一个角，标记正反。将 NC 膜置于 TBS 中在摇床上摇 3 次， 10 分钟 /次，倒去 TBS 液。2.封闭：加入 5%的脱脂奶粉溶液， 1h，倒去。3.一抗（ 1：10000）孵育 4过夜。4.取出 NC 膜，用 TBST 在摇床上洗三次，每次15min。5.封闭：加入 5%的脱脂奶粉溶液， 1h，倒去。6.用同样的方法，二抗（ 1：10000）孵育， 1h。7.取出 NC 膜，用 TBST 洗三次，每次 15min。4. 显影取两张塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。 将其中一张铺在X 射线摄影暗匣里。按照 1： 1 配制好显影液，混匀。将 NC膜平铺在第一张塑料膜上，将显影液均匀的铺在NC膜上 , 左右摇晃 X 射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面，用胶布粘住