水稻胚乳细胞生物反应器技术

1、水稻胚乳细胞生物反应器技术：高效制备重组蛋白的新利器生物谷生物探索2013.09.10摘妥：重组蛋臼药物是新药开发的重要方向之一。如今，重组蛋臼药物西然仅占全球处 方药市场的7-8%,但发展非常迅速，其中排名前十位的“重磅炸弹"药占总销僖额60%以 上。未来5-10年中国生物制药领域仍将以重组蛋臼为主流，这与世界生物制药领域的发展 趋势吻合。但是，宜组蛋臼生产能力不足已经成为重姐药物发展的瓶颈，生产能力不足导致 生产成本提高，在一定程度上限制了产业化。最新出现的水稻胚乳细胞生物反应器技术解决 了其他技术产童低、大规模生产困难等问題，成为髙效制备重组蛋臼的新利籠。1、技术简介水稻胚乳细

2、胞生物反应器技术，是以分子生物学为原理，应用遗传工程和DNA重组, 以水稻胚乳作为“生产车间”高效表达各类蛋白质，包括胚乳特异性表达、蛋白定向储存、® 组資白质的提取以及纯化技术。该技术貝有表达最高、成本低、规模化容易、加工工艺简单、 绿色坏保和安全性好的优势，各方面均优于细曲，酵母，动物细胞，转基因动物等生产体系， 将可部分取代基丁微生物发酵和动物细胞培养等重组蛋白药物的传统生产方式，対我国乃至 国际的生物医药生产方式产生较大影响，对推动我国生物医药的发展JV冇重要总义。表达系统总成本产品周期规模化生产能力产品性能糖基化污染风险存储成本细菌低低无内毒素中酵母屮中高不正确低中动物细胞

3、 培养高长极低极高正确阮病毒和致癌病毒贵转基因动 物离极长低极高正确阮病毒和 致癌病毒贵植物细胞 培养中中中高较小差 异低中转基因植 物极低长极岛岛较小差 异低低二、技术原理在成熟水稻胚乳中淀粉占90%,储存蛋白占8-10%o在水 稻胚乳细胞中储存蛋白主要有谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白和 白蛋白储存在水稻胚乳细胞中的两种蛋白体中，即蛋白体I和 蛋白体|。在水稻开花受精后，随着胚乳的发育，蛋白质通过 基因转录成mRNA,在内质网上合成蛋白质，新合成的蛋白质 通过信号肽进入内质网腔，然后经过高尔基体对蛋白质进行加 工与修饰，成为貝有完全功能的蛋白质，最终转运到这些蛋白 体中。整个过程是蛋白质不断的合

4、成，不断的积累，使得储存 蛋白总量在成熟时达到很高的水平。应用上述原理以水稻胚乳细胞为“生产车间”，釆用胚乳细 胞特异性农达，信号肽介导重组蛋白质定向储存，目的基因P, 一的水稻密码子优化等技术策略,不仅可以使重组蛋白像储存 水稻胚乳细胞蛋白合成不意图蛋白一样在蛋白体中人鼠积累而达到高效表达，而且可以防I匕细胞质蛋白酶的降解，在蛋白 质转运过程中还可以对重组蛋白质进行加工修饰，获得具何生物活性的重组蛋白质。再利用 水稻储存蛋白与重组蛋白的生化性质差异，将重组蛋白提取出來并进行纯化。在水稻胚乳细胞中特异表达巫组蛋白三、技术优势本表达技术平台是以种子为蛋白质生产车间來表达和生产各种医用、工业用的蛋

5、白质的 分子医药农业技术。种子生物反应器利用蛋白转运和储藏的机制可以使更组蛋白在翻译和转 运的过程中受到转运小泡等生物膜的保护，不会被细胞内的蛋白酶降解，而获得更高的表达 量。因此种子被认为是植物生物反应器的绘理想器官之一。通过种子生物反应器来表达各种蛋白质，将甫组蚩白质定向储藏在蛋白体，避免了蛋白 酶的降解，在种子成熟过程中不断地积累，从而获得较高表达；同时重组蛋白质进入内膜系 统，可进行正确地加工与折叠，产生具有生物活性的重组蛋白质。八体优势体现如下：1.表达量高：通过表达多种不同人源蛋白质，表达量在20-150微克/种子之间，折 合为0.10.75%的糙米車呂。各种蛋白质的表达虽总结如下

6、表。蛋白质种类分子量表达量（微克/粒）备注简单结构蛋白质13-100 kDa80-180HSA、乳铁蛋白等细胞生长因子类10-15kDa10-15IGF、FGF 等蛋白酶类13-100kDa30-120人溶菌酶、抗胰蛋白酶等复合蛋白质75-150 kDa20-50单克隆抗体2. 牛.物活件高：各种人体及动物细胞培养数据证明通过该平台表达的人血门蛋门的活 性比血浆来源的人血白蛋白活性高:PPE方式对比测试证明植物源重组抗胰蛋白酶比山场现 有抗胰蛋白酚产品的活性高出7.8%74.4%。3. 生产成本低：由F利用水稻胚乳生物反应器貝有校高的表达水平，人规模生产以农 业生产方式进行，因而生产成本极低，

7、相对丁其他生产体系，利用植物生产体系的生产成本 是英他体系的l/200-l/10o4. 规模化容易：由于水稻的繁殖细胞达到1000倍以上，一旦获得高表达的转基因品系 后，即可在短期内获得人规模生产，从基因介成到规模化生产（kg）只需要24个月时间。5. 安全性高：水稻是一种广泛种植、并II茂用了几年的谷物，尚未发现任何植物病 毒或病原菌与人类交义感染的先例，而Fl我们的提取和纯化匸艺可杜绝任何引进的病毒或病 原菌，以完全避免动物成分或病毒、病原菌通过医药产品进行传播风险。6. 储藏运输方便：种子是理想的”天然容器”，笊组蛋白质储藏在胚乳细胞的蛋白体内， 处于胶体状态，极为稳定，通常在常温下储藏

8、23年，即使胚损坏丧失了发芽能力,胚乳中 的蛋白质也不会丧失生物活性，因此原料储藏、运输不受时空限制。7. 低碳环保：利用水稻胚乳生物反应器生产医药产品，改传统生物发酵为现代农业种 植，蛋白质的合成与累积足由植物细胞通过光合作用合成，可以节省传统医药工业需要的大 量能源和原材料，符合现代工业低碳环保的理念。四、技术流程本技术包含基因载体构建、遗传转化、植株再生、蛋白质纯化等6个步骤，技术流程图 及技术步骤如下：在种子里特异表达技术流程图1、水稻胚胎细胞特:异性衣达我体的构建;克隆水稻胚乳特异性启动子Gtl3a,将Gtl3a启动子连接到表达我体上形成水稻胚乳细 胞特异性表达戟体。通过对水稻储藏蛋

9、白基因心动子结构的比校分析，Gtl3a W动子比国际 上专利保护的Gtl 动子转录活性高44.84%,通过多种重组蛋白质的表达实验证明，Gtl3a 可介导垂组蛋白在胚乳中高效和特异性表达，使植物生物反应器的表达量从纳克级提升到微 克级。2、水稻遗传密码子优化的產组蛋白质基因合成与表达我体的构建；将重组蛋白基因的氨基酸序列转化成含仃优化的水稻遗传密码子核苗酸序列，连接到水 稻胚乳细胞特异性表达载体上。3、将所获得的我体转化到水稻品种的愈伤再生组织中，经筛选和诱导获得转基因水稻植株；将带有冃的蛋白基因的表达载体甫组到水稻基凶中.与水稻自身的基因融合为一体.这 个整合后的基因组在水稻种株中表达形成转

10、基内种株，使得目的蛋白随着水稻口身的基月通 过转录.翻译、折叠等一系列过程表达出来，储藏在水稻种子中。Gtl3a介导重组蛋白进入水稻胚乳细胞的内膜系统并储藏在水稻胚乳的蛋白体中从而 使重组蛋白在水稻种子内人屋枳累最终达到较高的表达量以降低生产成本，为蛋白药物的生 产开辟了新途径。Protein gen©GM riceGM riceRecombinant plasmidtRe-generationEndosperm in seedGenetic transformation nce callus获取转基因水稻品种Recombinant proteinaccumulate in prot

11、ein body4、大规模种植转基因水稻获得转基内种子，并建立稳定的种子库；5、以转某因种子为原料.将其磨碎后加入提取缓冲液提取施组蛋H质:6、提取的蛋白质通过层析对提取的蛋白质进行纯化，去除杂质蛋白质而获得高纯度的 重组蛋白。基于现有水稻基因组数据和种子生物学的基础研究，针对水稻胚乳储藏蛋白和冃的蛋白 的理化性质差异，建立一整套从水稻种子中提取和纯化重组蛋白的工艺、工艺流程以及不同 重组蛋白质的提取纯化工艺设计的原则，然后利用此原则进行蛋白质纯化。该纯化工艺流程 包括种子加工、蛋白质提取与蛋白提取物预处理、膜处理、柱层析和超滤透析等技术。五. 技术常见问題与注意事项1、用水稻胚乳来表达重组蛋

12、白质所需要的时间？人概的费用？答：作为第一阶段：获得表达蛋白的转基因植株，需要10个月左右的时间，费用根据 貝体表的蛋白不同而不同，在50-80万/基因之间。第二阶段是纯化工艺，根据所表达的 蛋白不同，依纯化的难以程度业有所不同，一般在150-450万之间，在这阶段可获得小试 工艺和活性以及样品，达到规模化生产则需要2年左右的时间。2、水稻胚乳细胞生物反应器技术是否可以表达治疗用抗体药物？例如？答：完全可以。但存在糖蛋白修饰问题，目前正在建立人源糖苛化技术平台，估计在明 年可以建立人源化糖廿修饰的体系。3、分离纯化得到的蛋白的产量是由蛋白本身性质决定的还是由水稻自身转录调控系统决定 的？答：蛋

13、白表达是从DNA复制到RNA转录再到合成蛋白质的过程，它的表达量取决于3 个方面：1）启动子活性的高低.即RNA转录幽的活性，转录解的活性高，蛋白质产量不一定高， 还有蛋白质翻译的调控；2）蛋白质翻译水平的效应：3）蛋白质翻译后的调控，即蛋白质的降解过程。一旦合成蛋白质出现不能正确地折叠， 细胞启动一个叫做蛋白质降解程序，叫没折叠贵白质降解程序，将没冇功能的蛋白质降解:解决方法：1）采用高活性的启动子；提高转录水平；2）采用密码子优化：提高转录和翻译效应；3）定向蛋白质储存。将蛋白质放入水稻胚乳中的蛋白体储存，可以避免细胞质的蛋白 酶降解。4、怎样将蛋白质导入到水稻中？答：首先克隆出此蛋白质的

14、基因，然后把这段基因插入到双元农杆菌我体DNA中，带 有此蛋白质的质粒觅组到水稻基因中与水稻自身的基因组整介为一体，最后这个整合后的基 因组在水稻植株中表达形成转基因种株，从而啦组蛋白也随普水稻自身的基因通过转录、翻 译、折叠等一系列过程表达出来。六、最新的研究文献1 He Y et al. Large-scale production of fiinctional human semm albumin from transgenic rice seeds. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:19078 19083.2. Na An. et al. Expre

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