血管内皮生长因子、微血管密度与乳腺癌淋巴结转移及预后的关系

1、    血管内皮生长因子、微血管密度与乳腺癌 淋巴结转移及预后的关系        【摘要】目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）与乳腺癌淋巴结转移和预后的关系。方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）与免疫组织化学SP法，检测92例乳腺癌、12例癌旁组织V组织VEGF表达、MVD以及21例乳腺癌、12例癌旁组织VEGF mRNA的表达。结果乳腺癌组织，VEGF121（1.16%±0.1%）和VEGF165(1.01%±0

2、.1%)表达高于癌旁组织(0.96%±0.14%)、(0.88%±0.1%)，P<0.050.01。此外，MVD与VEGF表达具有显著的正相关关系（r=0.702,P<0.01）。VEGF表达和MVD与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发关系密切（P<0.050.01）。VEGF高表达组和高MVD组的无复发存活时间低于VEGF低表达组和低MVD组,差异具有非常显著性（P<0.01）。结论VEGF与乳腺癌血管生成密切相关；VEGF和MVD表达的增高对乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发有促进作用；VEGF和MVD对乳腺癌患者的无复发存活时间能起到预测作用。【关键词】乳腺肿

3、瘤；内皮生长因子；新生血管化，病理性；预后The relationship between vascular endothelial growth factor , microvascular density, lymph node metastasis and prognosis of breast carcinomaWANG Fulin(Email:w-fl), WEI Lixin, CHEN Lezhen. Department of Pathology, General Hospital of PLA. Beijing 100853, China【Abstract】ObjectiveT

4、o investigate the relationship between vascular endothelial growth factor (VEGF) microvascular density (MVD), lymph node metastasis and prognosis of breast carcinoma (BC). MethodsVEGF protein expression and MVD in 92 cases of BC and VEGF mRNA expression in part of the cases were studied by immunohis

5、tochemistry methods and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. ResultsVEGF mRNA expression in BC tumor tissues were higher than those in adjacent normal tissues. Increment of both VEGF121 and VEGF165 showed significant difference (P<0.050.01). In addition, VEGF145 exp

6、ression was also observed in BC. There was a close positive correlation between VEGF and MVD (r=0.702, P<0.01). VEGF protein expression and MVD correlated significantly with lymph node metastasis and tumor relapse (P<0.050.01). The time period of relapse-free-survival (RFS) in the patient grou

7、p with high VEGF expression and MVD was significantly lower than RFS in the group with low VEGF expression and MVD (P<0.01). ConclusionVEGF is highly related to angiogenesis of BC. The increase of VEGF and MVD may promote lymph node metastasis and relapse of BC. VEGF and MVD may have prognostic v

8、alue in RFS of BC patients.【Key words】Breast neoplasms；Endothelial growth factors；Neovascularization, pathologic；Prognoses肿瘤的生长与扩散取决于血管生成1。肿瘤细胞能够分泌众多的血管生成因子，其中血管内皮生长因子（VEGF）是最为重要的血管生成因子之一，VEGF通过增加微血管通透性，刺激血管内皮增殖，而促进肿瘤的微血管生成。我们采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学SP技术检测乳腺癌组织VEGF蛋白、VEGF mRNA的表达以及微血管密度（MVD），探讨其与

9、乳腺癌淋巴结转移和预后的关系。材料与方法1.收集我院19871991年间手术切除的乳腺癌肿瘤组织石蜡包埋标本92例。患者均为女性，年龄2978岁。每例标本做4 m厚的切片。92例肿瘤组织学类型为浸润性导管癌。其中淋巴结转移者52例。随访时间682个月，中位随访时间39个月，有36例肿瘤复发。肿瘤复发率：指乳腺癌根治术后，在随访期内肿瘤局部复发的病例数与总观察例数的比值。2.免疫组织化学方法：采用SP法，肿瘤组织切片进行微波抗原修复，多克隆抗-VEGF抗体（A20，Santa Cruz公司产品）和单克隆抗-CD34抗体（Zymed 公司产品）分别标记，DAB显色，以PBS缓冲液代替第一抗体作阴性

10、对照。3阳性判定标准及定量测定：（1）VEGF和CD34分别以肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。（2）在低倍视野下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，在200×视野范围计算3个视野的微血管数目，取平均值作为MVD列入分析。（3）对VEGF标记的切片选取阳性细胞密集区域，在高倍显微镜（400×）下选取100个阳性细胞（约35个视野），应用彩色象病理分析系统（微视-MVH-98型），测定平均吸光度（A，曾称光密度OD）值，以此代表阳性胞质单位面积内VEGF相对含量。4.RT-PCR：（1）选取新鲜乳腺癌组织21例及癌旁组织12例，采用异硫氢酸胍一步法提取组

11、织总RNA，进行RT-PCR。扩增产物经掺有溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳；紫外线检测并经凝胶象分析系统（英国UV公司）处理，以各条带的密度-面积乘积作为其定量。（2）VEGF扩增引物核苷酸序列2：上游引物：5-CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG-3；下游引物：5-TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3。 内参照基因三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物核苷酸序列3：上游引物：5-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3；下游引物：5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3。2对引物由中国科学院微生物所合成。主要试剂包括：总RNA提取剂（Trizol）和逆转录酶（M0-

12、MLV）,Gibco 公司产品，Tag酶、dNTP和六聚寡核苷酸随机引物（购自华美生物技术有限公司）。5.统计学处理：VEGF蛋白、MVD在病理因素中的定量统计采用方差分析，VEGF mRNA在癌和癌旁组织中表达的差异检验应用成组t检验，VEGF与MVD之间的关系运用等级相关检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存分析采用时序检验。结果1.VEGF mRNA表达：（1） PCR产物定性观察：在21例乳腺癌和12例癌旁组织中，VEGF mRNAs表达的PCR产物凝胶电泳结果见1。乳腺癌和癌旁组织主要有5条带，其中VEGF引物特异性带分别为403 bp（VEGF121）、475 bp（V

13、EGF145）、535 bp（VEGF165）和607 bp（VEGF189）。GAPDH引物带195 bp。（2）PCR产物的定量观察：分别以VEGF mRNA的PCR产物各条带定量与GAPDH的PCR产物条带定量的比值，作为各VEGF mRNA在组织中的相对含量。乳腺癌组织中VEGF mRNA表达高于癌旁组织，分别为：21.2%（VEGF121）、8.8%（VEGF145）、15.6% （VEGF165）、11.7%（VEGF189），其中VEGF121、VEGF165在癌和癌旁组织中的表达有显著意义（P<0.050.01），见表1。2VEGF蛋白表达、MVD及二者之间的关系：VEG

14、F阳性颗粒定位于肿瘤细胞的胞质内，部分癌旁上皮及血管内皮细胞阳性表达。VEGF阳性的肿瘤细胞分布呈异质性，着色程度较强的主要位于肿瘤细胞浸润区域。VEGF平均A值范围为0.1060.194（0.154±0.019），中位数0.153。肿瘤组织切片中血管内皮细胞染色程度均匀一致，微血管分布呈异质性，微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位（2，3）。微血管计数范围为11186（92.1±47.9），中位数87。VEGF与MVD的关系经等级相关检验证实，呈显著正相关（r=0.702，P<0.01），即MVD值随着VEGF表达程度的增加而增高，VEGF A值越大，MVD值就

15、越高。M：DNA分子量标记物，T：肿瘤组织，N：癌旁组织1乳腺癌肿瘤及癌旁组织VEGF mRNAPCR产物凝胶电泳结果表121例乳腺癌组织与12例癌旁组织VEGF mRNA相对含量的比较VEGF mRNAs分型GAPDH比值(±s)肿瘤组织癌旁组织VEGF1211.16±0.140.96±0.14*VEGF1450.79±0.120.72±0.12VEGF1651.01±0.100.88±0.09VEGF1890.88±0.090.78±0.07注：与肿瘤组织组比较：*P<0.01，P<0.0

16、5 3VEGF蛋白表达、MVD与淋巴结转移及肿瘤复发的关系：有淋巴结转移组的VEGF均高于无淋2乳腺浸润性导管癌，VEGF染色，肿瘤细胞呈阳性表达SP法×1003同上例，CD34染色，微血管分布于肿瘤细胞巢周围SP法×100巴结转移组，差异有显著性意义（P<0.05，P<0.01）。同样，肿瘤复发组与无复发组相比，前者VEGF、MVD高于后者（P<0.05，P<0.01），见表2。表292例乳腺癌VEGF表达、MVD与淋巴结转移及肿瘤复发的关系观察指标例数(±s)VEGFMVD淋巴结转移有520.159±0.019107.1

17、77;49.9*无400.148±0.01874.2±38.6肿瘤复发有360.158±0.019101.3±47.5*无560.147±0.02078.7±39.3注：与无转移和无复发组比较，*P<0.01，P<0.05 4VEGF蛋白、MVD表达与肿瘤预后的关系：分别以VEGF A中位数和MVD中位数为分界点，将患者分为VEGF高表达组与VEGF低表达组、高MVD组与低MVD组。在VEGF高表达组和VEGF低表达组中，复发率为52.2%（24/46）、26.1%（12/46）；在高MVD组和低MVD组中，复发率为58.

18、7%（27/46）、19.6%（9/46）。VEGF高表达组和高MVD组的复发率高于VEGF低表达组和低MVD组（P<0.050.01）。单变量分析显示，VEGF高表达组和高MVD组的无复发存活时间低于VEGF低表达组和低MVD组（P<0.01）。讨论VEGF是一种相对分子质量40 00045 000的分泌性糖蛋白。VEGF前体RNA包含8个外显子和7个内含子。对VEGF基因分子序列研究显示，VEGF蛋白8个外显子组成的单一基因转录后经剪切表达5种不同相对分子质量的VEGF mRNA，根据氨基酸长短依次命名为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF1

19、21。VEGF165、VEGF121 (可溶性)扩散力强，容易到达靶细胞，促进血管内皮细胞增殖，增加血管内皮细胞通透性，二者与VEGF的生物学活性密切相关。用RT-PCR方法观察VEGF mRNA在乳腺癌组织中的表达状况，并对其表达作相对定量检测，结果显示，乳腺癌组织中VEGF mRNA表达亚型有VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF121，并且肿瘤组织比癌旁组织VEGF mRNA表达量增高，VEGF121和VEGF165两个低分子量亚型表达量最高，与文献报道4相符。此外，MVD的高低与VEGF蛋白表达水平密切相关（r=0.702,P<0.01），在肿瘤细胞VEGF表达

20、较强的区域，MVD增高，表明VEGF是诱导肿瘤血管发生的重要调节因子，在肿瘤的血管生成中起着关键作用。在乳腺癌组织中还观察到VEGF145表达。目前对VEGF145报道很少，主要在女性生殖系统肿瘤的细胞株、子宫内膜、胎盘组织和羊胎膜组织中检测到少量的VEGF145表达。其表达常需第二轮PCR扩增才能观察到5。其在乳腺癌组织中表达的意义需进一步探讨。肿瘤新生血管是肿瘤细胞侵袭的首要靶目标，肿瘤细胞转移及其在转移部位的生长依赖于肿瘤血管生成。目前认为，肿瘤细胞的淋巴结转移有两条途径：（1）肿瘤血管生成促使肿瘤体积增加，肿瘤边缘部位的肿瘤细胞与淋巴管的接触增多，或者通过静脉-淋巴管吻合处从血液进入淋

21、巴管，并且，肿瘤的淋巴结转移率随着血液循环中肿瘤细胞的增加而增高，因此，肿瘤血管生成对淋巴结转移有间接的促进作用6；（2）从肿瘤微血管密度与淋巴结转移密切相关的结论中推测，由于对内皮细胞免疫标记的抗体不能区分淋巴管与血管，在肿瘤新生血管中肯定包含新生的淋巴管成分，虽然对血管生成因子作用于淋巴管的机制尚不明确，但是，血管生成因子可能对淋巴管内皮细胞同样具有促分裂和增殖作用，诱导“淋巴管生成”7。因此，肿瘤血管生成与淋巴结转移可能具有直接关系，它更有利于肿瘤细胞浸润淋巴管，促进肿瘤向淋巴结转移。在VEGF蛋白高表达和高MVD组中，肿瘤复发率和淋巴结转移率较低表达组明显增高。因此，可以根据二者的表达

22、水平，并与其他肿瘤标记物或形态学指标相结合，为筛选需要辅助性治疗的病例，并为以肿瘤内微血管为靶点的抗肿瘤血管生成的治疗提供客观依据。作者单位：王辅林（100853 韦立新（100853 参考文献1Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med, 1971,285:1182-1186.2Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Mutiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991,266:11947-11954.3Tokunaga K, Nakamura Y, Sakata K, et al. Enhanced expression of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in human lung cancers.