超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究

1、超抗原SEB活化耐受性NKT细胞亚群的研究                       作者：陈钰, 钟江 徐健, 陈中才, 郭业磊, 金婷, 张继慧 【摘要】  目的: 探讨超抗原SEB活化的效应细胞参与免疫耐受的NKT细胞亚群及分化特征。方法: 采用C57BL/J小鼠脾细胞经SEB诱导, 收集体外扩增10 d的淋巴细胞为效应细胞, 与刀豆蛋白（ConA）

2、、 脂多糖（LPS）和白介素2（IL2）共同培养3 d, 测定效应细胞对刺激剂的应答反应能力。在正常小鼠淋巴细胞与上述刺激剂反应的同时添加效应细胞, 3 d后测定效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激原的应答反应能力。用MTT染色方法记录细胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴细胞做参照, 用流式细胞术(FCM)解析了耐受性效应细胞中NKT细胞亚群并显示分化来源与功能的相关性。结果: 与正常淋巴细胞对抗原应答反应能力相比, SEB活化的效应细胞对ConA、 LPS和IL2的应答反应能力明显降低, 细胞生长的A值从正常组的0.80±0.04、 0.60±0.03和0.55±0.

3、07下降到0.60±0.05、 0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01, n=3)。效应细胞抑制正常淋巴细胞对上述抗原的应答反应, 尤其抑制ConA 活化的T淋巴细胞的应答反应; A值分别由正常值降低到0.26±0.002、 0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01, n=3)。效应细胞中CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT细胞亚群显著增加(P<0.05和P<0.01, n=4)。ConA活化的淋巴细胞是T淋巴细胞并包括CD4-CD8-/C

4、D3+ NK1.1+ NKT细胞。结论: 超抗原SEB活化的耐受功能与CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+NK1.1+NKT细胞亚群有关, 它们由T细胞分化而来。 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞没有参与耐受性调节。 【关键词】  NKT细胞亚群; 超抗原; SEB; 免疫耐受    NKT细胞是以NK细胞和T细胞两者为特征的, 仅占淋巴细胞群的1%1。NKT细胞的作用主要有两个方面, 效应功能和调节功能。它可以抑制Th1细胞的过激, 控制IL2, IFN的产生和后期的细胞增殖, 可以调节Th2细胞的细胞因子产生,

5、 使T细胞分化朝Th2方向偏移; 它也可以在Th1细胞抵抗感染和肿瘤时提供帮助以及可以阻止部分细胞的分化, 控制自身免疫病的发生和2。越来越多的研究报道了NKT细胞有很多亚群3, 4, 但是仍不能区别不同亚群的不同功能以及它们的来源和分化途径。我们以往的研究发现超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B,  SEB）能诱导外周淋巴细胞生成效应细胞, 这些效应细胞具有明显的抗排斥作用和免疫耐受特征, 并且均伴随NKT细胞的增加5, 6。本研究用超抗原SEB在体外扩增了具有耐受功能的效应细胞, 对这些细胞的耐受调节特征、 细胞亚群以及在外周淋巴

6、系统生成的NKT细胞的分化途径进行了研究。    1  材料和方法    1.1  材料  C57BL/J小鼠（雌性, 质量1820 g,  68周龄）来自解放军第301实验动物中心二级动物房。RPMI1640培养基购自Gibco公司, MTT染料（四甲基偶氮唑盐3（4.5dimethyiazolzyl）2.5diphenyl tetrazolium bromide）、 ConA和LPS均购自Sigma公司, 二甲基亚砜(DMSO)购自Solarbio 公司, 胎牛血清购自北京军区兽医防治中心,

7、 IL2由解放军302医院病毒研究所惠赠; SEB（自主知识产权, 专利号: 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE、 NK1.1APC和抗TcRV8PE荧光抗体均购自BD公司。    12  方法    121  正常小鼠淋巴细胞制备  摘取C57BL/J小鼠脾细胞在无菌台前分离细胞, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液, 经红细胞裂解, 洗涤2次后, 制备成密度为5×109/L个细胞的悬浮液待用。  &#

8、160; 122  SEB活化的耐受性效应细胞制备  在25 mL培养瓶中加入1×109细胞/L, 随后加入3.5 mL 400 g/L SEB混合后置37、  50 mL/L CO2孵箱培养5 d。洗涤换液后细胞继续培养到第10天, 收获细胞, 作为耐受细胞悬浮至5×109细胞/L用于抑制功能实验。    123  SEB活化的耐受性效应细胞对刺激剂的应答反应  在96孔板中加入5×105细胞/(100 L/孔), 并分别加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0

9、.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）, 对照组加入培养液。在37、  50 mL/L CO2孵箱培养3 d后MTT染色, 570 nm波长下测定细胞增殖的A值。    124  SEB活化的耐受性效应细胞抑制功能的测定  在96孔板中加入正常C57BL/J小鼠脾细胞5×105细胞/（100 L/孔）, 并在分别加入0.1 mL ConA(10 mg/L),  0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）的同时加入SEB活化的效应细胞5

10、×105细胞/（100 L/孔）。对照组为正常淋巴细胞分别加入上述相应刺激原。在37、  50 mL/L CO2孵箱培养3 d后MTT染色, 570 nm波长下测定细胞增殖的A值。    125  SEB活化耐受性效应细胞的T细胞和NKT细胞亚群解析  实验分为SEB和ConA两个组。在96孔板中加入5×105细胞/（100 L/孔）, 并分别加入0.1 mL SEB(400 g/L)和0.1 mL ConA(10 mg/L),  在37、 50 mL/L CO2孵箱中培养。取培养第10天的细胞经抗CD3

11、PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、 NK1.1APC和TcRV8PE荧光抗体四染色后, 用流式细胞仪（FACs Calibue BD,  USA）测定T细胞、 NKT细胞亚群增殖的百分数并记录NKT细胞亚群分化途径。    126  统计学分析  计量资料用x±s表示。采用t检验分析。所有数据均用CHISS统计软件处理。    2  结果    21  SEB活化的耐受性效应细胞对

12、刺激剂的应答反应性下降  用ConA、 LPS、 IL2分别刺激正常淋巴细胞或SEB活化效应的细胞, 3 d之后MTT方法检测细胞增殖并记录增殖的A值。SEB活化的效应细胞对ConA、 LPS和IL2的应答反应能力由正常的0.80±0.04,  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.60±0.05,  0.30±0.05及0.27±0.04 (P<0.01,  n=3,  图1)。    图1  SEB 活化的效应细胞对刺激剂的应

13、答反应    Fig 1  The response of the effecter cells by SEBactivated to several mitogens    eff.cells:  The effector cells by SEBactivated.  bP<0.01 vs control group.    22  SEB活化的耐受性效应细胞抑制正常淋巴细胞对刺激剂的应答反应  正常淋巴细胞在分别加入ConA、 LPS、 IL2

14、的同时加入SEB活化的效应细胞, 经培养后, 正常淋巴细胞与刺激原的应答反应能力明显受到抑制, 尤其抑制正常细胞与ConA的应答反应能力。细胞的增殖能力由正常值由正常A值0.80±0.04、  0.60±0.03和0.55±0.07下降到0.26±0.002、  0.48±0.04及0.34±0.02(P<0.01,  n=3,  图2)。    23  SEB或ConA活化T淋巴细胞亚群的比较  在SEB活化的具有耐受功能的效应细胞中CD

15、3+、 CD4+ T细胞亚群百分数分别由原始的27.52%和15.04%下降至18.74%和12.35%(P<0.01, n=4), CD8+T细胞百分数略有增加, 由原始的16.11%上升到23.18%（P>0.05）, TcRV8+T细胞从10.55%上升到28.48%（P<0.01, n=4）。ConA活化的淋巴细胞主要是T淋巴细胞, 包括CD3+、 CD4+、 CD8+和TcRV 8+T细胞亚群。它们分别由最初的27.52%、 15.04%、 16.11%和10.55%上升到41.72%、 36.49%、 54.21%及25.86%（P<0.01, 

16、n=4, 表1)。表1  SEB或ConA活化的T细胞亚群百分数    24  SEB和ConA活化的NKT细胞亚群的比较  在SEB活化的耐受性效应细胞中, 明显增殖的细胞是CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+ 和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT细胞亚群, 它们分别由原始的0.86%、 1.72%和0.92 %上升至9.53%、 7.02%和3.34%(P<0.05, P<0.01, n=4); CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT细胞没有显著性增加。相反ConA活化了CD4-CD8-CD3+ N

17、K1.1+NKT细胞, 使这群细胞的百分数由原始的1.51%上升至2.81%（P<0.05, n=4）, 但不能诱导其他NKT细胞亚群活化增殖（表2）。表2  SEB或ConA活化的T细胞亚群百分数    25  SEB活化的NKT细胞亚群的分化途径  图3、 4的结果显示了NKT细胞亚群的生成途径。SEB活化的CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT细胞均由T细胞分化而来。SEB和ConA 诱导的CD4-CD8-/CD3+ NK1.1+ NKT细胞亚群主要由NK细胞分化而来（图5）

18、。1             3  讨论    NKT细胞是独立的细胞群, 最初把它定义为T、 B和NK 细胞之后的第4类的淋巴细胞。最近的研究报道了NKT细胞有可能是T细胞亚群而不是淋巴细胞亚群7, 它们可以被糖脂类抗原GalCer活化而发挥免疫调节作用。近年来有学者报告了一些内源性细菌产生的糖脂质也能活化NKT细胞8, 9。我们以往的研究发现多肽类超抗原SEB能诱导小鼠外周淋巴细胞大量增殖, 但是增殖后的淋巴细胞功能与ConA活化的淋巴细胞完

19、全不同。把SEB活化早期的淋巴细胞再次暴露于ConA、 LPS和IL2, 其二次应答反应完全消失; 而ConA活化的淋巴细胞对抗原的二次应答反应能力依然存在。为了阐明SEB活化的耐受性机制以及参与耐受调节的NKT细胞亚群, 本研究获得了SEB体外扩增的效应细胞。经 ConA、 LPS及IL2刺激后这些效应细胞显示出对刺激剂的应答反应明显降低; 当正常淋巴细胞用上述3种刺激剂活化的同时添加效应细胞, 淋巴细胞对刺激剂的应答反应受到抑制, 细胞增殖的A值显著降低。SEB活化的效应细胞之所以具有很强的耐受功能在于它们不仅降低了T、 B细胞对ConA和LPS的应答反应能力, 还有效地抑制了正常淋巴细胞

20、对刺激剂的应答反应能力。强烈地抑制ConA活化的T淋巴细胞的增殖, 表明效应细胞的抑制作用带有一定的特异性。用流式细胞术解析了这些具有耐受功能的效应细胞中T细胞和NKT细胞亚群。发现与ConA活化的T细胞相比, SEB活化的细胞主要是NKT细胞。这些NKT细胞亚群包括CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+和TcRV8+/NK1.1+的NKT亚群细胞;  CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞亚群无显著性增加。相反, 尽管ConA是经典的可以选择性刺激T细胞增殖的丝裂原, 由ConA活化的淋巴细胞是T淋巴细胞而不是NKT细胞, 但也表现出CD4-CD8-NKT细胞的增加

21、（P<0.05）。与具有耐受功能的效应细胞相比, ConA和SEB 诱导生成的 CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞主要来自NK细胞; 而SEB活化的耐受性效应细胞中的NKT细胞均来自T细胞。这些结果暗示出参与耐受性调节的效应细胞主要是CD4+NK1.1+、 CD8+NK1.1+、 TcRV8+/NK1.1+NKT细胞亚群, 它们由T细胞分化而来。由NK细胞分化而来的CD4-CD8-/CD3+NK1.1+NKT细胞不参与耐受性调节。    致谢:  感谢解放军总基础医学研究所实验仪器中心王珊技师在流式细胞测定方面给予的热情帮助; 感谢实

22、验动物中心给予的协助。【】  1 Van Kaer L. Regulation of immune responses by CD1drestricted natural killer T cellsJ. Immunol Res, 2004, 30（2）: 139-153.2 Beaudoin L, Laloux V, Novak J, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the Development of pathogenic T cells specific for pancreatic cel

23、lsJ. Immunity, 2002, 17(6): 725-736.3 Joyee AG, Qiu H, Wang S, et al. Distinct NKT cell subsets are induced by different chlamydia species leading to differential adaptive immunity and host resistance to the infectionsJ. J Immnol, 2007, 178(2): 1048-1058.4 Seino K, Taniguchi M. Functionally distinct NKT cell subsets and subtypesJ. J Exp Med, 2005, 202(12