抗中性粒细胞胞浆抗体的检测及临床意义

1、抗中性粒细胞胞浆抗体 (ANCA) 检测及临床意义间接荧光免疫 (IIF) 方法(欧盟)一、 ANCA概念及分类 抗中性粒细胞胞浆抗体是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为靶抗原 的自身抗体，对系统性血管炎炎症性肠病等多种疾病的诊断和鉴别诊断具有重要 的意义，已成为自身免疫性疾病的一项非常重要的常规检测项目。目前，已经有十余种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA的靶抗原，蛋白酶3(PR3)，髓过氧化物酶 (MPO)，人白细胞弹性蛋白酶 (HEL)，乳铁蛋白 (LF) ，组织 蛋白酶 G(Cath G)，杀菌/ 通透性增强蛋白 (BPI) ，人溶酶体相关膜蛋白 2 (H-LAMP2)， 溶菌素 (

2、LYS) ，天青杀素，防御素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶。根据乙醇固定的中性粒细胞基质片中，可以区分两种不同的荧光模型： 一种胞浆型( c-ANCA)，是均匀分布在整个中性粒细胞胞浆中的颗粒型荧光， 细胞核无荧光。在乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片中，其荧光模型表现相同。其 主要的靶抗原是蛋白酶 3(PR3)。另一种是核周型( p-ANCA)，是围绕中性粒细胞细胞核周围的平滑带状荧光。 由多种抗原引起，主要靶抗原是髓过氧化物酶 (MPO)，人白细胞弹性蛋白酶 (HEL) ， 乳铁蛋白 (LF) ，组织蛋白酶 G(Cath G)，杀菌/ 通透性增强蛋白 (BPI) ，人溶酶体相 关膜蛋白 2 (H-LA

3、MP2)，溶菌素 (LYS)等。不同抗体在乙醇和甲醛固定的中性粒细 胞片中，其荧光模型表现有所不同。抗 MPO抗体产生的 p-ANCA因耐甲醛，其荧光 模型与在乙醇固定的中性粒细胞中出现的 c-ANCA类似故叫甲醛抗性的 p-ANCA。而 其他非 MPO抗体不与甲醛固定的中性粒细胞反应，无荧光表现，这种类型又称为 甲醛敏感的 p-ANCA。故根据乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片表现， 可初步判定 ANCA 的靶抗原 PR3， MPO，非 MPO三类。、 ANCA的检测间接荧光免疫方法是检测 ANCA的参考方法或者标准方法， 至今也是最常用的 经典方法。 IIF 是区分 c-ANCA和 p-ANCA

4、的基础，有较高敏感性，可半定量，但 IIF 测定的是总 ANCA，不能准确区分靶抗原，需特异性的检测方法作为补充。由于多种免疫性疾病患者存在 ANA，用 IIF 法检测 ANCA时，会产生干扰实验结果的判断。为避免干扰现象，采用了四基质联合的检测即：乙醇固定的粒细胞；甲区分 ANA的干扰： Hep-2 细胞有典 型荧光表现，Hep-2 细胞甲醛固定 粒细胞1：判断 c-ANCA， 2：区分 p-ANCA对甲 醛敏感还是 耐受甲醛抗性 p-ANCA：抗 MPO抗体耐 甲醛，其荧光与在乙醇固定的中 性粒细胞中的 c-ANCA类似甲醛敏感 p-ANCA：其他非 MPO抗 体不与甲醛固定的中性粒细胞反

5、 应，无荧光表现区分 ANA与 ANCA：借助猴肝细胞 和其中的肝血窦粒细胞。 ANCA阳性，只有肝血窦粒细胞出 现荧光，。如果两者同时阳性，所 有肝细胞核都有荧光。猴肝 细胞乙醇固定 粒细胞是标准实验基质。区分两种荧光模型： c-ANCA； p-ANCA。醛固定的粒细胞； Hep-2（人喉癌细胞）细胞；猴肝细胞。基质片各细胞分布及意义如表一所述。 ANCA荧光模型及表现如表二所述。表一：四联基质片分布及意义表二： ANCA荧光模型及表现荧光模型荧光表现乙醇固定粒细胞甲醛固定粒细胞Hep-2 细胞猴肝细胞A N A 阴 性c-ANCA阳性胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清 晰勾勒出核的轮廓

6、， 分页核之间荧光增 强。胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清 晰勾勒出核的轮廓， 分页核之间荧光增 强。阴性肝细胞本身无荧光。仅肝血窦粒细胞出现 荧光。p-ANCA 阳性甲醛 耐受 p-ANC A呈现核周胞质平滑丝 状带荧光。荧光阳性 的胞质主要集中在分 页核周围，形成环状 或不规则的块状。胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清 晰勾勒出核的轮廓， 分页核之间荧光增 强。阴性肝脏细胞本身无荧光。仅肝血窦粒细胞出现荧光。甲醛呈现核周胞质平滑丝阴性阴性肝脏细胞本身无荧光。敏感p-状带荧光。荧光阳性 的胞质主要集中在分 页核周围，形成环状 或不规则的块状。ANCA仅肝血窦粒细胞出现荧光。A N

7、A 阳 性ANCA阴性细胞核阳性，荧光强度增强阴性细胞核呈现 荧光表现， 如ANA所述肝细胞核阳性。 肝血窦粒细胞未见荧 光。甲醛耐受 p-ANCA阳性细胞核阳性，荧光强度增强荧光表现如 c-ANCA阳 性，乙醇，甲醛固定粒细胞所述细胞核呈现 荧光表现， 如ANA所述。肝细胞和肝血窦粒细 胞都有荧光。甲醛敏感 p-ANCA阳性细胞核阳性，荧光强度增强阴性细胞核呈现 荧光表现， 如ANA所述。肝细胞和肝血窦粒细 胞都有荧光。三、注意事项为提高对疾病诊断的特异性，检测时应注意以下问题1、检测 ANCA，一般建议同时做 IIF 初筛和确认实验，以提高 ANCA的临床应用价 值，不做单独初筛或单独确认

8、实验，以免降低对疾病诊断的特异性。2、不能仅检测抗 PR3和 MPO两种特异性抗体，而不检测，这样容易限制 ANCA对 疾病诊断的特异性。3、用 IIF 检测时，仅使用乙醇固定的粒细胞片，这样不能严格排除ANA的干扰，容易出现假阳性。四、临床意义(一) ANCA与原发性小血管炎韦格纳肉芽肿 (WG)，显微多动脉炎 (MPA)，坏死性新月体性肾小球肾炎 (NCGN) 和变应性肉芽肿性血管炎 (CSS)等等原发性系统性小血管炎的发病与 ANCA密切相 关，临床上已将上述疾病统称为 ANCA相关小血管炎。 ANCA特, 异性 PR3抗体和抗 MPO抗体的检测已成为原发性小血管炎的敏感特异的血清学检测

9、项目。1、抗 PR3抗体特异性 PR3抗体为 WG的标志性抗体，抗 PR3抗体荧光模型以 c-ANCA为主。 但以 c-ANCA诊断 WG特异性为 90，而以抗 PR3抗体的特异性可超过 95。抗 PR3 抗体在其他的原发性血管炎中业可以检测出来，但阳性率较低。抗 PR3抗体敏感度与疾病的活动性及病程有关，在疾病的早期症状不明显时， 就可出现阳性。因而抗 PR3抗体常作为 WG的早期诊断、疗效判断、复发估计的指 标，对临床治疗有重要的参考价值。2、抗 MPO抗体抗 MPO抗体荧光模型以 p-ANCA为主，主要与 MPA、NCG、N CSS相关。还可见 于其他疾病，如节结性多动脉炎，抗肾小球基底

10、膜肾病， WG， SLE，RA，药物诱导 的狼疮， Felty 综合症等。抗体滴度与疾病活动性相关，可用于早期诊断、疗效判 断、复发估计的指标，对临床治疗有重要的参考价值。抗 MPO抗体阳性高度提示坏死性血管炎或特发性 NCG，N 对诊断原发性小血管 炎的特异性达到 99。因而每一个不明原因的血管炎或肾小球肾炎的患者，都应 该检测 ANCA。表三： ANCA与原发性小血管炎相关疾病荧光模型靶抗原（）韦格纳肉芽肿 （WG）C ， P（少见）PR3（85），MPO（10）显微多动脉炎 （MPA）C ，PPR3（45），MPO（45）坏死 性新月体 性肾小 球肾 炎（NCGN）C ， P（少见）PR

11、3（25），MPO（65）变应性肉芽肿性血管炎 （CSS）C ， P（少见）PR3（10），MPO（60）结节性多动脉炎（ PAN）少见PR3（5），MPO（15）抗肾小球基底膜病（抗 GBN）PMPO（二）ANCA与药物诱导性血管炎近年来不断有药物治疗引起的 ANCA阳性的病例报道，如丙基硫氧嘧啶，肼 苯哒嗪，普鲁卡因酰胺，青酶胺，美满霉素，他巴唑 / 甲巯咪唑等。其中报道比较 多的是长期使用丙基硫氧嘧啶引起的 ANCA，其特点是滴度高，抗体谱广（抗原主 要是 MPO，也可同时伴有或单独出现其他靶抗原，如 PR3，LF，Cath G，BPI，LYS 等）。药物诱导性血管炎患者临床表现与原发性

12、血管炎类似，停止丙基硫氧嘧啶用 药后，临床症状好转， ANCA可转阴。因此，长期使用丙基硫氧嘧啶治疗过程中， 应定期检测 ANCA，及早发现药物诱导性血管炎。（三）ANCA与其他疾病除原发性血管炎外，其他一些疾病中也可出现 ANCA，主要为 p-ANCA，其靶抗 原并非 PR，MPO，而是 LF， Cath G，BPI，LYS等1 、慢性炎症性肠病 （CIBD）CIBD 是一种消化系统的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎（ UC），克罗恩 病（ CD）两种。以往的 CIBD诊断依赖 X 线检查，内窥镜及组织学诊断，缺乏有效 的试验室指标。近年来研究发现 UC病人血清中 ANCA阳性率为 60-80 ，而 CD患 者的阳性率为 10-20 ，多为 p-ANCA，相关靶抗原有 BPI 等。滴度与疾病的活动 度和病程无关。因为 p-ANCA在 UC阳性率高， CD阳性率低，故可作为两者的鉴别 诊断及 UC早期诊断指标。2、结缔组织病在结缔组织病中， ANCA阳性主要见于 SLE 和 RA，其他结缔组织病中少见。但文献报道在 SLE和 RA阳性率差异特别大（ 16-69 ），这可能与使用方法，抗原基质片及工作人员水平有很大关系SLE中 ANCA阳性可能与慢性炎症反应有关， 如动脉炎，浆膜炎和 CRP增加等。 有报道抗 MPO抗体与 RA的关节外损害及血管损害有关。3