质粒的提取和鉴定,DNA酶切ppt课件

1、碱变性法小量提取质粒，DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组实验目的 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择适宜载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子。质粒(plasmid) 是染色体外可以进展自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器主要指线粒体和叶绿体和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 是染色体外可以进展自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器主要指线粒体和叶绿体和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。分别质粒DNA的 根本步骤 培育细菌使质粒扩增； 搜集

2、和裂解细菌； 分别和纯化质粒DNA 质粒DNA的提取方法 碱变性法碱裂解法； 煮沸裂解法； 羟基磷灰石柱层析法； 质粒DNA释放法； 酸酚法等。 碱变性裂解法根本原理： 在碱性条件下pH 12.6，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋构造解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状构造的两条互补链不会完全分别，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，构成缠绕的致密网状构造，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一同沉淀下来而被除去。原理表示图质粒DNA电泳电场中DNA分子

3、的迁移速度取决于：DNA分子本身的大小DNA分子的空间构型超螺旋构型ccDNA)线形DNA(lDNA)开链环状DNA(ocDNA)复制中间体没有复制完的两个质粒连在一同)溴化乙锭EB是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 Attention, please! EB是强诱变剂，配制和运用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必需进展清洗或弃去！质粒提取实验资料与试剂 实验资料：实验资料： 过夜培育大肠杆菌过夜培育大肠杆菌DH-5aDH-5a 实验试

4、剂：实验试剂： LBLB培育基培育基 0.1M NaCL 0.1M NaCL、10mM Tris.CL10mM Tris.CLpH8.0pH8.0、1mM EDTA1mM EDTA、Amp 50mg/mlAmp 50mg/ml、酚、酚、氯仿、氯仿、RnaseRnase、琼脂糖、琼脂糖 TETE：10mM Tris.CL 10mM Tris.CL pH8.0pH8.0，1mM EDTA1mM EDTA 溶菌酶溶菌酶 10mg/ml 10mg/ml用用10mM Tris.CL10mM Tris.CL，pH8.0pH8.0，新颖配制新颖配制 溶液溶液溶菌液：溶菌液：50mM 50mM 葡萄糖，葡萄糖

5、，25mM 25mM Tris.ClTris.ClpH8.0pH8.0，10mM EDTA10mM EDTA，2mg/ml 2mg/ml 溶菌酶。溶菌酶。 溶液溶液 NaOH-SDS NaOH-SDS液：液：0.2N NaOH0.2N NaOH，1% 1% SDSSDS。 溶液溶液 3mol/L NaAc 3mol/L NaAcpH4.8pH4.8溶液：溶液：5M 5M KAC 10mlKAC 10ml，冰醋酸，冰醋酸 11.5ml 11.5ml，水，水 28.5ml 28.5ml。步骤一 细菌培育与质粒扩增 1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培育液中含Amp 50g/ml，37

6、 225rpm振荡培育过夜。活化菌种 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培育基500ml中，37振荡培育3-4小时OD6001.0 3.取4ml培育液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并反复一次，弃上清，取沉淀。 步骤二 质粒提取取4ml培育物至Eppendorf管中，12000rpm，4，离心30sec，弃上清。用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并反复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽能够枯燥。将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，参与10 l溶菌酶10mg/ml，猛烈振荡均匀，冰上放置1分钟。加200L溶

7、液II新颖配制，盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟 。5.参与150L溶液III 冰上预冷，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 离心5min，将上清夜转至另一1.5ml Eppendorf管中。7.参与等体积酚/氯仿1：1，振荡混匀，室温放置5-10min，12000 rpm，4 下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.参与2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 离心5分钟。9. 倒去上清，参与1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。1200

8、0 rpm，4 离心2分钟。10弃上清并尽量吸除液体，翻开管盖，室温放置5min。室温放置15min枯燥。1150l TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 g/ml)，使DNA完全溶解-20保管12取样品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。 M pBSK pGFP菌体老化菌体老化碱裂解不充分碱裂解不充分菌体中无质粒菌体中无质粒溶液运用不当溶液运用不当请涂布平板培育后，重新挑请涂布平板培育后，重新挑选新菌落进展液体培育选新菌落进展液体培育可减少菌体用量或添加溶液可减少菌体用量或添加溶液的用量的用量不要频繁转接，每次接种时不要

9、频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素应接种单菌落。检查抗生素运用浓度能否正确。运用浓度能否正确。溶液溶液在温度较低时能够出在温度较低时能够出现浑浊，置于现浑浊，置于3737保温片刻保温片刻直至溶解为清亮的溶液。直至溶解为清亮的溶液。q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何处理？问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何处理？ 缘由缘由对对策策质粒DNA提取常见问题混有蛋白混有蛋白混有混有RNARNA混有基因组混有基因组DNADNA不要运用过多菌体。重新纯化不要运用过多菌体。重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多酚，去除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质参与参与RNaseARNaseA室温放置一

10、段时间室温放置一段时间参与溶液参与溶液II II 和和IIIIII后防止猛烈振荡后防止猛烈振荡，能够把基因组，能够把基因组DNADNA剪切成碎剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培片从而混杂在质粒中。细菌培育时间过长会导致细胞和育时间过长会导致细胞和DNADNA的降解，培育时间不要超越的降解，培育时间不要超越1616小时。小时。质粒DNA提取常见问题q问题二：质粒纯度不高，如何处理？问题二：质粒纯度不高，如何处理？ 缘由缘由对对策策提高质粒产量的本卷须知 参与溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III后PH

11、要到达中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才干使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否那么，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 参与乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，留意察看水相和乙醇之间没有分层景象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 DNA的限制性酶切Plasmid (质粒) Plasmid map Polylinker Sequence map Restriction enzyme mapPolylinker (多克隆位点Sequence Map GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGC

12、TCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC

13、G CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGG

14、CGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGT

15、CCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAT

16、GCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAG

17、TGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGT

18、GTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGA

19、GGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCRestriction map 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶: : 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中特定碱基顺序的核酸中特定碱基顺序的核酸水解酶。水解酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的磷酸二酯键，产生的DNADNA片段片段5 5端带磷酸端带磷酸基团，基团，3 3端为端为-OH-OH。限制

20、性核酸内切酶分类 识别切割特性 催化条件 能否具有修饰酶活性 至2005年1月，共发现限制酶3681种 型59种 型3612种 型10种 商业化的限制酶有 588 种，在 型限制酶中共有 221 种特异性。EcoRI型限制与修饰系统 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进展切割，产生特异的DNA片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反响的辅助因子，识别顺序普通为4-6个碱基对的反转反复顺序； 型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。 酶切反响中应留意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其

21、他内切酶或外切酶的污染；留意内切酶的识别位点和构成的粘性末端；2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。运用中普通以1 g DNA用2-3U酶进展酶切为宜；3. 内切酶体积：不能超越反响体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超越5%会抑制内切酶的活力；4. 操作条件：反响体系配置应在低温下进展冰上；运用时防止操作中对内切酶的污染。5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些要素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 反响缓冲液：1. 反响缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2

22、+ 为内切酶的辅基；A. Tris-HCl维持反响体系的PH值在7.27.6之间；B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl)2. 酶解的温度：大多数限制酶的反响时间为37，如EcoR、Hind、BamH、Pst等，也有如Bcl需在50下进展反响。3. 酶解反响时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原那么是酶/DNA23，12小时即可充分酶解。4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反响条件下 ， 0.05mL反响混合物中, 1小时消化1g底物DNA的酶量为1单位(1U)。双酶真实验资料 限制性内切酶：EcoR、Xba和Hind DN

23、A：DNA和质粒pCDNA-p38 10buffer H 37, PH7.5 90mM TrisCl 50mM NaCl 10M MgCl2 10buffer M37, PH7.5 6mM TrisCl 100mM NaCl 6M MgCl2 1mM DTT 10BSA： 1mg/ml 无菌水方法和步骤1. 1. 反响体系配制：反响体系配制：质粒质粒pCDNA3pCDNA3p38 10 p38 10 l l1 1g g 10 10buffer M 2 buffer M 2 l l 10 10BSA BSA 2 2 l l EcoR EcoR 1 1 l l Xba Xba 1 1 l l H2O H2O 4 4 l l 总体积总体积 20 20 l l2. 将反响体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心搜集液体。3. Eppendorf管于37水浴中反响1.5小时。4. 反响终了后70灭活15min或者参