松材线虫、松墨天牛和松树间的共生关系

1、得分： 南京林业大学研究生课程论文201520016学年第二学期森林保护3150462王立超 黄麟课 程 号： 课程名称： 论文题目： 学科专业： 学 号： 姓 名： 任课教师：二O六年六月Tsfehk1 Iuf Pinas rfensi/ihfij and E ihtmberii bells uxtd in experimcnli内容本文研究松材线虫、松墨天牛和真菌在松树中的共生关系 实验材料和方法： （1）真菌小长喙霉在PDA平板上、25C条件下培养一周，使用前在 5C 条件下保存。灰葡萄孢在 10 mL 的大麦籽粒上培养。（2）线虫强毒虫株松材线虫T-4在25 C条件下在灰葡萄孢上培养，

2、使用 前在5C条件下保存。松材线虫悬浊液包括成虫和幼虫，悬浊液浓度 为 50000 条/mL。（3）昆虫松墨天牛在恒定条件下培养（25C, 16h光照、8h黑暗），让其 繁殖 10 代，第七代到第十代成虫用来在赤松小苗上产卵，收集天牛 所产的卵并将其放置在湿纸巾上，在一天之内孵化的幼虫用于实验。（ 4）松枝2014年六月采伐两颗12年生（胸径分别为3.9和5.2cm）的赤 松和两颗12年生的黑松（胸径分别为8.1和9.0cm）,分别在实验1 和实验 3中使用。 2015年二月采伐 3颗 1 2年生的赤松用于实验 2， 胸径分别为 7.4、 7.6 和 8.4cm， 2014年十月采伐一颗 12

3、年生的赤松 用于实验4,其胸径为6.8cm。树枝截为15cm一段，在树枝的两端用 石蜡密封起来， 每个实验组树枝的树木特定的每组树枝之间不存在显Tsfehk1 Iuf Pinas rfensi/ihfij and E ihtmberii bells uxtd in experimcnliExpcrirncni number and spccLes inaculated on pine Pine bolts uscdlbbells":_N umber Length (mm.lIJiamc悴址m)Bark surface (cm-)Exprrinienl I where R. densi

4、flor belli were usedR. :vylphilus1114.8 ± 0atl4_3-16.0>4 4±a3»(3 2-6)20氐4 士 16.1 a(145.2fl.6)1B.屮血即加加乩 M uitematus1214.8 ±0.1 a(l4J-15.5)42 ±03 a (2.7-6.21195J ± 11711(123.-273.5)B.:xyhphihis. O. minus1214 ±0.1 a £ 14.4-1 S.2)4.3 i 0.3 a < 2.76.0197.9 &#

5、177; 12.9 a (：126.7-275.Of乩 j(y治philu乩 M0.狀询辭1214.8 ±0.0 a (14.6-14J)4.3 ± 03 a (3.0-5.511M,2 士 U.S a (1.6-255.8)Esperinienl. 2 where £ dnjiflora boJti were usedfi. .Kyhphilust 0,冊曲"1013jQ±Q，HK6-li9)5.9 ±0,1 (5-5-6 J)2!U)3±3.9(254.i)-2'5.5)Ea-perimenl. 3 where

6、E 由m刃首芒碍“ bulls were used.W. akeniantsW14-8 ± (11 a tl4.3-15.5rft.6 ±0.4a(4.Ck9.1|孙6.4 士 16.7 3 092.6-42*5.1)Af.衬加啊删叫B,Pl+S±ai 3(14.3-15.66,C3r03a(4.l-K.S)307,J 二 15.6 j (192 2-407,U)M.乩 O. mimis1914.8 ±0J 1(14.2-13.565 ± 03 h (3.9-8 7)303-0 ± 6.2 a(177.3-40L5)M. oUernm

7、：, H. xylnphiM. f). flfifws20H-8 -hfl.l (135-I1Qfi.$±0-4MW301,9 ± 13,9 (177.0-417,6)E 丸 pefimrili 4 Mshere Ebull*； Hit re UMrd.W. alieninntx, O. mmux614.8 ± 0.1 (14-5-15.1)5.9 ±0.1. (5.7-63.)276.6 ±6.2 (>1.0-300.5) Species inc" u訓讯 arc 帥miph討剧血 xyhphil,and Op曲吨ww 脚币纱

8、打土 5Ei Meani fulluwcd by die N4inK Idler un 甘 cvlumin in 閒rh eprrimnl dk? not di fTcrw币 w趺h tuher (une-iiiy ANOVA. BvnfcfTuni'smulliple cwmpsiriMjn vf pairwise muiinyh Numtruh in parenLhtr&es show the ruinige(5)接种使用凿子和镊子在离树端13.7mm处从木质部分离树皮(面积22.3mmx 17.3mm),用刻刀在漏出的木质部中间挖一个直径6-7mm圆形刻槽用以放置松墨天牛

9、幼虫，一份带有灰葡萄孢或则没有灰葡萄孢 的面积为5X 5mm的PDA培养基放置在远离树端、接近圆形刻槽的位 置。用到划长16.8mm最大宽度为14.3mm的三角形裂口，在漏出的 韧皮部接种20uL的线虫悬浊液(1000条线虫)或者是无菌纯净水。 两个树皮伤口最小距离平均为13.7mm两个伤口接种后覆盖原来的树皮，用封口膜包起来，即使不接种松墨天牛幼虫，也挖一个小刻槽， 实验4中松树枝条不用接种松材线虫悬液或水，不会在树皮上形成倾 斜伤口。15cm实验一、为了确定松墨天牛幼虫和小长喙霉对松材线虫种群生长的影响， 一组赤松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉。第二组枝条接种 松材线虫、松墨天牛和P

10、DA第三组枝条接种松材线虫和小喙长霉， 第四组枝条接种松材线虫和 PDA他们被垂直放置使线虫远离容器底 部。25C, 16h光照、8h黑暗，相对湿度100%条件下常温培养，用 纯净水保持湿度。接种18天后，从松枝上剥离树皮，从枝条上取幼虫和幼虫粪便， 记录韧皮部和木质部上蓝变面积确定小喙长霉的繁殖情况，从纵向韧皮部上剥离四份之一到二分之一的树皮，将树皮外层剥离，收集里面树皮以获得韧皮部样品，再将里层树皮的韧皮部剪切为1-2mm大小的 树皮块，使用一把15mm宽的刀片，从接种松墨天牛幼苗和松材线虫 的地方包括髓取木质部样品，记录木质部样品真菌繁殖情况，粪便、 韧皮部和木质部分别在25 C下使用贝

11、尔曼漏斗法分离48-72h，计算 分离线虫浓度，材料在60C下烘5-12d，称重，线虫密度表示每克材 料干重中松材线虫的数量。分别使用电子天平和游标卡尺测量幼虫体重和头壳宽度，分别精确到O.lmg和0.05mm根据头壳宽度确定幼虫龄期：0.585 - 1.170,1.260 - 1.935, 1.980 3.150和 3.150 4.365 mr分别为一龄、 二龄、三龄和四龄虫。实验二、确定赤松中韧皮部、木质部和天牛幼虫蛀屑线虫密度的不同，在2015年2月26日将刚孵化的幼虫、1000条松材线虫和一份接有小长 喙霉的PDA接种在10条直径相似的上述赤松枝条上，2015年3月26 日分别将韧皮部

12、、木质部和幼虫蛀屑用以分离线虫，确定线虫密度，实验三、确定松材线虫种群和小喙长霉对松墨天牛生长发育的影响，四组黑松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉三个物种组成的四种组 合。方法和实验一方法相同，培养条件相同。每天观察松枝，记录松墨天牛羽化情况，分性别记录成虫数量， 体重和鞘翅长分别精确到 0.1mg和0.05mm没有松墨天牛出现的松 枝在接种153-164d后分离，称量幼虫的鲜重和记录头宽、颜色、肠 内排泄物的有无以及幼虫所在的位置。实验四、为确定松墨天牛幼虫对小喙长霉繁殖的影响， 6个赤松枝条接种 小喙长霉和松墨天牛幼虫，接种22d后，剥离松枝树皮，幼虫蛀屑和 幼虫取样，测量幼虫体重和头

13、壳宽度Hbhl普 3 Effects ofxyhphit andl冊加m inoculalitKii nn the gmMh and developmental time nf 卅讪沁卿昭皿2尸血伽 in jPjjutf.thalts (ExpcrinKnt 3)Species i 仃xulatcd on pine botesaduhjh thjft emerged fnatn pine holts'S«Number of adults Body mass 4mg)El viral lengths mm Develupmenlal lime (da),5jh.W. cthem

14、afusFemale5443.8 ± 34.9 (3-50.2-563A)16.6*0.6(15.3-18.8)1034 ±9.5 (B6-I36)Maleg45S 9 ± 45.2 f260.S-596.3)I5.&± 0.5 (13.5-17.4101.1 ±氐1個2置M uitvmafus,. .tyluihituaFerrt1y.lc斗511.1 ± 35.2 (426.2-593.5)17.5 ±0.4 (IG.6-85>11093 ± 19.7 GB-167)Male10426 6

15、77; 19.0 (J32.1-519 6)15-4 ±0.2 (14-164)91.8 ±2S (82-108)M.0.Female5395.5 ±31.5(305.0-476.7)16.2 ±0.5(14.9-17.497.6±2JQ(W-10t)Mule6536.7 士 珂吊(W5.B-6O5J)16.6 ±0.4 (14.7-17.6>113.5 ±8.5 (87-149)Af crflemtrftTj. B. xyhphihis.Female9506.3 ± 43.0 (M8.6-754.5 )17

16、 J ± 0.5 (14.2-191053 ±8.8 (71-155)O. J?丽 N3Male64«| .7 ±匾2 ±04(1*15102.7 ± 9,0(81-130)M看m 士 SE. Numeral s in parentheses(he rungeDevelupdimethe lJiglh Lime between I”川 imiiKruhliofi “nd udull emergence文章结构摘要关键词、 、- 刖言材料与方法真菌线虫传播媒介松树枝条接种方法实验一实验二实验三实验四数据分析结果赤松枝条中松墨天牛幼虫和小

17、喙长霉菌对松材线虫种群的影响（实验 一）松墨天牛幼虫的粪便中高密度松材线虫的再现（实验二）黑松枝条中松材线虫和小喙长霉菌对松墨天牛生长发育的影响（实验 三）赤松枝条中松墨天牛幼虫对小喙长霉菌的影响（实验四）讨论参考文献设计思路实验一为研究赤松枝条中松墨天牛幼虫和小喙长霉菌对松材线虫种群 的影响，实验选取年龄和粗度相似的赤松为材料，分四组实验进行， 一组赤松实验材料只接种松材线虫、一组赤松材料接种松材线虫和松 墨天牛，一组赤松材料接种松材线虫和小喙长霉菌， 最后一组赤松实 验材料接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉菌，四组实验之间彼此形 成对照，通过测量不同接种组合、不同部位的松材线虫密度和松墨天

18、牛的体重和头宽指标来确定三者之间的相互影响。实验二为研究韧皮部、木质部和天牛幼虫粪便中线虫密度的不同，刚孵 化的松墨天牛、松材线虫和小喙长霉菌接种在10个粗细相似的赤松 枝条上，按照实验一发法在各部位取样，测定松材线虫密度。实验三 为研究松材线虫种群和小喙长霉菌对松墨天牛生长发育的影响， 在四组黑松实验材料上按照实验一中接种方法接种松材线虫、 松墨天 牛和小喙长霉菌三个物种的组合。 每天观察记录松墨天牛成虫出现情 况，测定体重和鞘翅长度指标。在接种后 153-164 天后，解剖没有松 墨天牛出现的松树枝条，称量记录活天牛幼虫的头宽、身体颜色、排 泄物状态和其在松树枝条内所在的位置。实验四研究松

19、墨天牛对小喙长霉菌影响， 6 个赤松枝条接种松墨天牛和 小灰长霉菌， 24 天后，在接种位置上剥离树皮，从松树枝条上取下 幼虫和幼虫粪便， 取整个松树枝条四分之一到二分之一的树皮 （包括 天牛取食过的树皮，不包括石蜡覆盖的树皮）去除外层树皮，韧皮部 切成 1-2cm 宽的小块，使用手钻在接种松墨天牛和小喙长霉菌的位置 取韧皮部包括髓，松墨天牛粪便、韧皮部和木质部放在聚乙烯袋子里， -20 C下保存，两天后，在真空状态下冻干。测定麦角固醇含量。结果和结论实验一在接种 18天后，解剖松树枝条， 在树皮下发现 20只活的天牛幼 虫和 4只死的天牛幼虫，活天牛幼虫包括 1个一龄幼虫、 2个二龄幼 虫和

20、17个三龄幼虫，平均体重 99.2mg,平均头壳宽2.23mm,在幼 虫肠道内发现粪便。解剖实验表明在单独接种松材线虫的 11 个松树 枝条中有 6 个松树枝条可观察到小喙长霉菌, 在接种松材线虫和人松 墨天牛的 12 个松树枝条中有 9 个松树枝条可观察到小灰长霉菌,在 单独接种小灰长霉菌的所有松树枝条上的木质部和韧皮部均有真菌 分布。 在未接种松墨天牛幼虫的松树枝条, 木质部和韧皮部的分别分 离到线虫量为2.2g和2.9g，在接种松墨天牛幼虫的松树枝条上，木 质部、韧皮部和粪便中分别分离到 3.6g、3.2g和0.29g松材线虫。平 均线虫密度随接种位置、 松墨天牛幼虫及真菌的有无而不同,

21、 在未接 种真菌的松树枝条木质部的松材线虫密度小于其他接种位置的松材 线虫密度, 小于接种真菌的松树枝条。 未接种松墨天牛幼虫的松树枝 条线虫密度大于接种松墨天牛幼虫的松树枝条线虫密度。 双因素方差 分析表明, 在接种松墨天牛幼虫的受接种位置和真菌有无影响, 但不 受接种位置和真菌互作影响, 松材线虫密度在粪便中最大, 其次为木 质部,最小为韧皮部。Tubk 2 Effcclii of Munochamuxhirvaje <Liod Ophivsltfrna mmua on BMrphetnchtts xylphiluj dtn.'sily per g of dried byrk

22、. Jiyleimu汕kl fras& in 尸Ewj dciflfrnt bales-E囂ptri打叱im numibcr aii>d sptNo. of bi?lh NumiicodE deriiiiy inaci新 imoculatedl on pine bolls239.4 ± 102.2 (22.5-1 L80.1>74.7 i 29 J (1.3-382.3)5SI .2 土 105需(IOMI 367Q3723.3 土 832.6 (2&6场肋195.8 ±38.6 (6J-S623)9254.9 ± 3856.6 (77

23、2.736454-214.6 ± as c (0.7-73.9)9MJD ± 313J a (93.8-5278.7)15.0± 7j6c(D.7-73;9f)2850.0 ± im_0a(91S-19607剧B. xy tophiftfsII409.8 ±97.5 (83.9-1274.5)R. .iT/opfrr/wj, M. tilienrams12256.4 ±38.8 (54.9-5583)H, xyhphiiu (X12968.8 ± 200.7 (1533-22W.4)fl. xrtopffifiSr M. d

24、/JfprrtfJuII2615 ±57J (59.8-5837)O> mnn sI where 胃 &阳肿極 bolh were usedPhloemXylemFrassEsperiment 2 where P densifiora balSs wen? iiiiicdK xytf>phiiusr M. fillematus, 炉4J.» ± 3.6 b (9.9-1 )4.S)0 H,i,liiS104B.1 ± 12.6 b (9.9-114 SiJ Mein 士 St.fol I g胡 hy the Mime letter i

25、n i td d* not differ 1 価 nn 皿ti 训 her仙r leg-ihinnn)eJ 赋 nuitodg density, B-nnfcrrani's. multiple ca-mparison of pairwise mcanj；. Nittnerah in parentheses show the rangeb Excludiri the diu utKaintd from u pine Mil where u beetle liirva dod实验二在接种刚孵化的松墨天牛幼虫的赤松枝条中存在天牛粪便，解剖发现9个活的天牛和1个死亡的天牛幼虫，活天牛幼虫平均体

26、重为 118.4mg,头壳宽2.19mm,表明活天牛为三龄幼虫，死亡天牛头壳宽 为1.35mm,说明此为二龄幼虫，解剖实验发现在10个松树枝条的韧 皮部存和5个松树枝条的部分木质部存在真菌。 韧皮部、木质部和粪 便线虫密度为5.3g、3.3g和0.52g。双因素方差分析表明，线虫密度 受接种位置影响，但不受松树枝条影响，松材线虫密度最大为天牛粪 便、其次为韧皮部和木质部。Tubk 2 EfFcGly of Mnochamus 配/Jfe亦口*月 Uarviw jnd Oph诂Ema minus ohi UMrsaphetnchus xyithiM deitsily per g of drjed

27、 byA, xykm,.;ukl frtis in 尸irtMj divr占训fit tool帼Exprininm number aiid spe moculdikdl on pine be*N 仇 of bi?lhNemiii:区k de roily inaPWocmXykmFrassEMpriinicni: 1 where 胃buln* wert usedfl. jriiophifftsII409.8 ±97.5 (83.9-1274.5)239.4 ± .1.02,2 (22.5-1180.1)R. .iT/opfrr/rji, M. tilienrams12256.

28、4 主?8.Sf»4.9-55S.3)74.7 ± 29 J (1.3-382.3)3723.3 土 832.6 (2&6场期H, xyhphiiu (X1296S.Szt 300.7( 155.5-22W.4F581.2 ± 105 .SflW.S-1367.0)fl. xrtophifis. M. d/JfprrtfJu11261.5±57J (59.8-5837)195.8 ±38s6 (6J-S623)9254.9 ± 3856.6 (772.7-O. m旳财36454-2>Espcriment 2 where

29、P. densifiora bolus weir u*iedH, xyhphil艰眦虱hm碱e 炉44.8113.66(9.9-1141)14.6 ± 8.5 c (0.7-73.5)9MJD ± 313J a (93.8-5278.7)O. minus|048± !Z6b (9.9-114.8)15.0 ±X6c(B.7-73;9)2850.0 ± im_0a(91S-19607剧"士 SE. Meunx fallow胡 hy the 窝lfw letter in / row do oor diiffer from 哒h ether

30、 (twi>way AN0%A Icif kug-lransfcsmied tKm-iitode density, BDnfcrroni multiple comparison of pairwiic meansL Nitaierul'i in parcnlhcscs show the rangeh Excluding the dau ublaintd from ii pine I>u4l where ii beclJc liirva did实验三在接种幼虫后的71天到167天期间出现23只雌天牛和30只雄 天牛，在接种后153-164天后解剖松树枝条发现在木质部蛹室内发现

31、 11只活天牛幼虫和9只死亡天牛幼虫，活天牛幼虫平均体重为982.3mg，头壳宽为3.89mm，体色为黄白色到黄色，表明他们是四龄 幼虫。方差分析表明成虫的体重不受真菌接种实验、线虫接种、性别、树皮面积和彼此之间互作关系影响。方差分析也表明天牛鞘翅长度受 真菌和松材线虫互作关系、真菌、松材线虫和树皮面积三者互作关系 的影响，但是不受真菌、线虫和树皮面积的影响。雌天牛的鞘翅比雄 天牛鞘翅长。鞘翅长度与树皮面积呈负相关关系。方差分析显示接种 天牛幼虫后，天牛成虫出现时间不受真菌、线虫、树皮面积和天牛性 别以及彼此之间互作关系的影响。Table J Efleds of U时tuphfhzh#占iin

32、dmr/j-Hj inocu liilkwi mo the gruwEh ndi developmejitd time of AftwcitAamujahernatas in Pinw-ybullst (Exptrimeni! 3)Species inoculiicedl on pine balteM, w/rrFtrif5 adulbi ihiiL eiTicjnged friKH pin« bolt讣SexNumber of adu l13odly m古薪 lmg|Ektral length 4 mm *Developmental tiimf (days.M.皿推m&hn

33、Female5443.S 士 34.9(350.2-563.6)16.6 i 0.6(15.3-18.81103.4 i 9.5 S6-I3邱Mal«8*58.9±J5-2 (MO-5%,3>U.S± »,5 (13,5-17.4)I.0IJ ± 6.1AJ.B. lyiaphihFemale4511± 35.2 (4262-5933)173 ±0.4 (16.6-18.5)109.3 ± 19.7(78-167)M且k10426.6 ± 19.0 032 JI-5I4.Q15.4 ±0.

34、2 (14.2-16.491 8X8 (82-1 (Mi)M. mAve川删(A mnusFemale55J±3l-5 (3l)5.O-47fi.7j1&2±0J (14.9-17.4)97 ±2.0(93-104)Male6536.7 ± 34.8 (395.&-6O5.3)16.6 ±0.4 (14.7-17.6)113.5 ±8.5 ( 87-149)M. altemalus, R. XYiaphihis,Female954)63 士 43.0(338.6-754.5)17 J. ± 0.5(14.2-

35、193)105.3 ±0(71-155JO. mintjriMak64L7± 36,4(389.9-642)162 ±04(15,4-17.6)102,7 ±9JD(&I-I3O)Mejji i SE. Numerals in parrnthes亡却 show Lhe ranguDcvclopmcnlaJ lime show苫 the length of time between larval inoculation and adult emergence实验四在接种22天后，在松树枝条发现 6只活天牛幼虫，平均体重 171.2mg,平均头壳宽为

36、2.4mm,表明他们为三龄幼虫。天牛粪便的 麦角固醇含量最大，其次为韧皮部和木质部，方差分析显示三者之间 存在极显著差异。Twble J Eflels of U时曲phf 柚zh站und Ophiahmu minus inoru laLiim uio Lhe gruweh nd development 6me of AftweitAamuj ahernatM in Pinw.ybull* (Exptrimeni: 3jSpecies inwuliiEed on pineM,起加rrwiiuy adulh ihiiL emtrgcd frufia pine bolts"nouns.Se

37、xNumber of adults13odly m古哥 lmg|Eljtral length immliDevelopmental tiimf (dsys.M.皿推m&hnFemale5443.S 士 34.9(350.2-563.6)16.6 i 0.6(15.3-18.81103.4 i 9.5 S6-I3邱kkl«8158.9 ±45-2 (2Ml.W-5W.3jL5±0J (13.3174)loi.i ±6.1(«-m)AJ. altemaftij, B. lyiaphihFemale4511± 35.2(4262-5

38、93_5)173 ±0.4 (16.6-18.5)109.3 ± 19.7(78-167)Male10426.6 ± 1.0(332一引弘时L5,4±02 (14.3-16.4)(82-108)M-諒僅密貝皿删(>, 加榊Female51&2±0J (14.9-17.4)97 ±10(9(3-104)Male6536.7 土 34.8 (395.&-6O5.3)16.6 ±0.4 (14.7-17.6)113.5 ±8.5 ( 87-149)M. alternates, B. XYiaphih

39、is,Female95fi6.3±40i3?S.f-7M.5)(7.1 i 0.5 (14.2-19311053 ± 8 (71-155)O. minuriMak64BL7± 36,4(389.9-642)162 ±04(1517.6)102,7 ±9JD (81-130)Mcm ± SE. Numerals in parentheseji show Lhe rurifeDcvclopmcnlaJ dmc show苫 the length of time between larval inoculation nd adult emer

40、gence创新性指导意义实验过程控制单因素变量，实验测定的指标多样，可以从不同角 度反映实验结果，实验分析多样化，实验数据多次筛选，层层分析，增加数据可靠性。不足之处实验中只考虑线虫取食小喙长霉菌， 没有考虑线虫取食松树枝条 活细胞的实验四研究松墨天牛对小喙长霉菌影响， 实验中在 6 个赤松枝条 上均接种松墨天牛幼虫和小喙长霉菌， 但未在赤松枝条上单独接种小 喙长霉菌作为对照。ReferencesAkbulut S, Linit MJ (1999) Flight performance of Monochamus carolinensis (Coleoptera: Cerambycidae)

41、with respect to nematode phoresis and beetle characteristics. EnvironEntomol 28:1014 -020.Arakawa Y, Togashi K (2002) Newly discovered transmission pathway of Bursaphelenchus xylophilus from males of the beetle Monochamus alternatus to Pinus densiflora trees via oviposition wounds. J Nematol 34:396

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