霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化、酶学特性及外界影响因素研究

1、霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化、酶学特性及外界影响因素研究    英文题名 Isolation, Purification, Properties and Its Outer Factors of Phenylalanine Ammonia Lyase(PAL) in D. Huoshanense  关键词 霍山石斛; 苯丙氨酸解氨酶; 纯化; 酶学特性; 外界因素; 英文关键词 Dendrobium huoshanense; Phenylalanine ammonia lyase（PAL）; Purification; Properties

2、; Outer factors; 中文摘要 霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng)产于安徽省霍山县,是国家重点保护的传统名贵药用植物;其富含石斛多糖和生物碱等多种生物活性成分,具有益胃生津、滋阴清热、抗衰老、提高机体免疫力等功效。但由于霍山石斛中生物碱含量普遍较低,无法满足市场的需求,因此,加强霍山石斛次生产物合成调控,提高生物碱含量,促进药用品质改善,成为霍山石斛研究中的重点。 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5) ,是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶,其主要

3、催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸,可为多种酚类、生物碱、类黄酮等终产物提供前体物质。已有研究表明石斛生物碱含量与PAL活性有关,PAL可能是石斛属植物生物碱合成的关键因素之一。研究霍山石斛PAL可以为进一步研究PAL在生物碱调控中的作用机理提供基础,还可以为常规育种或生物技术育种创造高含量生物碱的霍山石斛提供基础。本研究以霍山石斛组织培养试管苗为材料,进行了PAL的分离纯化、基本酶学性质和外界影响因子的研究。主要研究结果如下: 采用35%-75%. 英文摘要 The herb of Dendrobium huoshanense is a kind of precious traditiona

4、l Chinese medicinal materials in Anhui Province and is protected by government for its medicinal value.Because it has affluent amylose and alkaloids,it can diminish inflammation,clear the sight and improve the immunity of human body.But because of its low alkaloids content,it has been unable to meet

5、 the needs of the market.So strengthening the secondary metabolitess synthesize control,increasing alkaloids content and accelerating  摘要 3-5 Abstract 5-6 1 文献综述 9-17     1.1 霍山石斛研究概况 9-10     1.2 植物苯丙氨酸解氨酶的研究进展 10-17         1.2.

6、1 PAL 的分布 10         1.2.2 PAL 的分离纯化与定量测定 10-11         1.2.3 PAL 的基本特性 11         1.2.4 PAL 的催化作用机制 11-12         1.2.5 各种因子对PAL 活性的影响 12-13    

7、     1.2.6 PAL 对植物生理代谢的意义 13-14         1.2.7 PAL 在重要次生代谢产物调控中的应用 14-17 2 引言 17-18 3 材料与方法 18-25     3.1 试验材料 18     3.2 测定项目及方法 18-20         3.2.1 苯丙氨酸解氨酶活性测定 18   

8、0;     3.2.2 蛋白质含量的测定 18-19         3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 19-20     3.3 试验设计 20-23         3.3.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶分离纯化条件的优化 20         3.3.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化

9、20-21         3.3.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的酶学特性研究 21-22         3.3.4 外界因素对霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的作用研究 22-23     3.4 主要仪器和试剂 23-24         3.4.1 主要仪器 23-24         3.4

10、.2 主要试剂 24     3.5 数据的处理与分析 24-25 4 结果与分析 25-49     4.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶分离纯化条件的优化 25-28         4.1.1 分离纯化材料的筛选 25         4.1.2 蛋白质标准曲线的制作 25-26         4.1.3 离子交换条件的优化

11、26-28     4.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化 28-33         4.2.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的DE-52 离子交换层析 28-29         4.2.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-50 脱盐层析 29         4.2.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-150 分子筛层析 29-

12、31         4.2.4 SDS-PAGE 电泳测定分子量 31-33         4.2.5 PAL 的紫外扫描 33     4.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的酶学性质研究 33-41         4.3.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶反应进程曲线 33-34        

13、 4.3.2 PAL 的最适pH 34         4.3.3 PAL 的酸碱稳定性曲线 34-35         4.3.4 PAL 的pH 耐受性研究 35         4.3.5 PAL 的最适温度 35-36         4.3.6 PAL 的温度耐受性研究 36-37   &

14、#160;     4.3.7 底物浓度对酶活力的影响 37         4.3.8 酶液浓度对酶促反应的影响 37-38         4.3.9 PAL 动力学曲线与米氏常数（Km）的测定 38-39         4.3.10 底物专一性研究 39-40       

15、0; 4.3.11 霍山石斛PAL 贮存性质研究 40-41     4.4 外界因素对霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的作用研究 41-49         4.4.1 重金属离子对PAL 活性的影响 41         4.4.2 活性中心常见金属离子对PAL 活性的影响 41-43         4.4.3 A1(3+)盐不同形态对PAL 酶活性影响 43

16、        4.4.4 金属鳌合剂EDTA 及其钠盐对PAL 活性的影响 43-44         4.4.5 氨基酸对PAL 活性的抑制作用 44-49 5 讨论 49-54     5.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化 49-50     5.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶分子量的测定 50     5.3 关于PAL 酶的基本性质 50-52  

17、   5.4 金属离子对PAL 活性的影响 52     5.5 氨基酸对PAL 活性的抑制作用 52-54 6 结论 54-56 参考文献 56-62 致谢 62-63    3.4 主要仪器和试剂 23-24         3.4.1 主要仪器 23-24         3.4.2 主要试剂 24     3.5 数据的处理与分析 24-2

18、5 4 结果与分析 25-49     4.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶分离纯化条件的优化 25-28         4.1.1 分离纯化材料的筛选 25         4.1.2 蛋白质标准曲线的制作 25-26         4.1.3 离子交换条件的优化 26-28     4.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化 2

19、8-33         4.2.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的DE-52 离子交换层析 28-29         4.2.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-50 脱盐层析 29         4.2.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-150 分子筛层析 29-31         4

20、.2.4 SDS-PAGE 电泳测定分子量 31-33         4.2.5 PAL 的紫外扫描 33     4.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的酶学性质研究 33-41         4.3.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶反应进程曲线 33-34         4.3.2 PAL 的最适pH 34     

21、60;   4.3.3 PAL 的酸碱稳定性曲线 34-35         4.3.4 PAL 的pH 耐受性研究 35         4.3.5 PAL 的最适温度 35-36         4.3.6 PAL 的温度耐受性研究 36-37         4.3.7 底物浓度对酶活力的影响

22、 37         4.3.8 酶液浓度对酶促反应的影响 37-38         4.3.9 PAL 动力学曲线与米氏常数（Km）的测定 38-39         4.3.10 底物专一性研究 39-40         4.3.11 霍山石斛PAL 贮存性质研究 40-41   

23、0; 4.4 外界因素对霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的作用研究 41-49         4.4.1 重金属离子对PAL 活性的影响 41         4.4.2 活性中心常见金属离子对PAL 活性的影响 41-43         4.4.3 A1(3+)盐不同形态对PAL 酶活性影响 43         4.4.

24、4 金属鳌合剂EDTA 及其钠盐对PAL 活性的影响 43-44         4.4.5 氨基酸对PAL 活性的抑制作用 44-49 5 讨论 49-54     5.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化 49-50     5.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶分子量的测定 50     5.3 关于PAL 酶的基本性质 50-52     5.4 金属离子对PAL 活性的影响 52   

25、  5.5 氨基酸对PAL 活性的抑制作用 52-54 6 结论 54-56 参考文献 56-62 致谢 62-63    3.4 主要仪器和试剂 23-24         3.4.1 主要仪器 23-24         3.4.2 主要试剂 24     3.5 数据的处理与分析 24-25 4 结果与分析 25-49     4.1 霍山石斛苯丙氨酸

26、解氨酶分离纯化条件的优化 25-28         4.1.1 分离纯化材料的筛选 25         4.1.2 蛋白质标准曲线的制作 25-26         4.1.3 离子交换条件的优化 26-28     4.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化 28-33        

27、 4.2.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的DE-52 离子交换层析 28-29         4.2.2 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-50 脱盐层析 29         4.2.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的Sephadex G-150 分子筛层析 29-31         4.2.4 SDS-PAGE 电泳测定分子量 31-33    &

28、#160;    4.2.5 PAL 的紫外扫描 33     4.3 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的酶学性质研究 33-41         4.3.1 霍山石斛苯丙氨酸解氨酶反应进程曲线 33-34         4.3.2 PAL 的最适pH 34         4.3.3 PAL 的酸碱稳定性曲线 34-35         4.3.4 PAL 的pH 耐受性研究 35         4.3.5 PAL 的最适温度 35-36         4.3.6 PAL 的温度耐受性研究 36-37         4.3.7 底物浓度对酶活力的影响 37