海参多糖的分离纯化方法及其主要生理作用.

1、青岛农业大学本科生课程论文论文题目海参多糖的分离纯化方法及其主要生理作用学生专业班级应用化学 2009 级 1 班学生姓名（学号）XXXXXXXXX）指 导 教 师 XXXXXX完成时间2011年11月11日2011年 11 月 11日海参多糖的分离纯化方法及其主要生理作用摘要：海参（ sea cucumbers ）是民间珍贵的药膳食品，海参体壁中含有的多糖成分具有抗肿瘤、抗血凝、抗放射、增强免疫力等多种生理功能。本文介绍了海参多糖的提取、分离、纯化级纯度鉴定方面的相关技术，阐述了海参多糖生物活性及开发途径，并提出其研发方向。关键词 ：海参多糖；分离纯化方法；生物活性一、海参多糖的分离提取与纯

2、化海参多糖具有良好的保健功能，许多海参多糖的产品已作为保健食品进行开发。以刺参为原料研制的海参口服液，认为其对机体的免疫调节和抗肿瘤的作用显著。目前，海参多糖主要应用于保健品或化妆品 J ，很少开发成药物，主要原因是海参多糖分离纯化技术难度大。多糖是亲水性大分子物质，它的分离纯化方法有别于小分子物质，而且不同的多糖具有不同性质，必须采用不同的分离纯化方法。1 海参多糖的分离提取方法多糖是极性大分子化合物，通常破碎后的原料常用水做溶剂来提取粗多糖，但海参多糖是含有糖胺聚糖的酸性粘多糖在热水中溶解度不大，通常采用碱提取法和酶解法。（ 1） 碱提取法一般使用稀 NaOH溶液或 KOH溶液进行提取，此

3、法可以从组织中对海参多糖进行较完全的提取，但多糖分子有可能被碱进一步降解，因此在提取时所采用碱的浓度、碱解温度和时间都应优化筛选。通常使用的稀碱溶液的浓度在 5 一 10之间，温度保持在 10以下，否则多糖容易发生降解反应。（2） 酶解法糖胺聚糖是通过共价键与蛋白聚糖的核心蛋白相接，并通过静电作用或立体化学效应和其他蛋白质发生专一性程度不一的结合，在制备 GAG时常用降解蛋白的手段使与之结合的 GAG键得以释放 J 。蛋白酶解法是目前 GAG提取过程中使蛋白质与聚糖分离最为广泛应用的方法，酶解后用沉淀法可获得海参粗多糖。蛋白酶解法在蛋白酶消化组织时，一般选用对肽键断裂作用专一性低的、谱广的微生

4、物酶和植物酶为宜。例如选择链霉蛋白酶 (pronase 、碱性蛋白酶 (nagarase 或 subtilisin 和木瓜蛋白酶等以达到最大水解效果，动物性蛋白酶如胰蛋白酶的使用也较为普遍。较酶法提取的多糖蛋白含量低，由于碱作用广泛，并且作用强，能够裂解肽链和糖链，但是碱液作用强，很可能引起糖基的脱落和结构的改变，对组织的蛋白降解不如酶解作用有效，酶作用相对温和，用酶解法能够保护糖链和部分肽链，保持多糖分子的完整性。因此，可采用碱提取法结合酶解法提取海参多糖，可以更有效的降低多糖中的蛋白质的含量，同时保持多糖分子的完整性和其生物活性。2 海参多糖的纯化海参多糖经去色素、去蛋白等杂质后，为了能更

5、好的探讨海参多糖的性质，还有必要对其做进一步的纯化。目前，多糖的分离纯化方法主要有分级沉淀法、盐析法、金属络合法、有机盐沉淀法、季胺盐沉淀法和柱层析法等。海参多糖的纯化一般是采用柱层析法，此法效果好且操作简单。（1）纤维素柱层析纤维素层析柱用纤维素填充，柱内纤维素用乙醇平衡好，将多糖混合物全部沉淀于隋性多孔的纤维素柱上面，然后用不同浓度乙醇水溶液洗脱，使不同的多糖就依次洗脱出来。在洗脱过程中，各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离出来。这种方法实质上与分级沉淀法相反，可称为“分级溶解法”，其理论塔板数较高，所以流出液的纯度较高。该法的缺点是流速慢，纯化周期长，不大适应粘度

6、大的酸性多糖的分离纯化。（2）阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析 l3_ 是目前多糖纯化中最常用的一种方法。它适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖。它的分离机理不是单一的离子交换，而更重要的是吸附与解吸附，所以其不仅可应用于中性多糖与酸性多糖的分离，也可应用于不同中性多糖的分离。一般在pH值为 6 时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，然后用pH值相同、离子强度不同的缓冲液将酸多糖分别洗脱下来，如果柱为碱性 ( 即 OH一型，则中性多糖也能吸附。目前应用最广泛的阴离子交换剂有二乙基氨基乙基纤维素 (DEAE cellulose，DEAE一葡聚糖 (DEAE Sephadex及 DEAE一

7、琼脂糖 (DEAESepharose 三种。陈健等 _1 纠在研究分离糙海参酸性粘多糖中，把粗多糖经 DEAE Sepharose F F柱层析进行分级纯化，以05molL 的NaC1为洗脱剂，按 5mL体积分部收集，以硫酸一苯酚比色法测定多糖的含量，合并多糖出峰部分，真空冷冻干燥即得糙海参多糖的白色纯品。DEAE SepharoseFF是新近使用阴离子交换剂，其化学性质稳定，流速快，较上述三种交换剂使用更广泛。二、生理活性1、抗肿瘤作用近年来，有关海参酸性粘多糖抗肿瘤的研究取得了积极进展。吴萍茹等用两种方法从二色桌片参鲜品中提取多糖，提取物分别为糖蛋白I 和含糖量较高的糖蛋白，该两种多糖为含

8、有岩藻糖和岩藻糖硫酸酯的直链均一多糖，不含有其它糖基。药理活性研表明，糖蛋白明显抑制小鼠 S180 肿瘤细胞的生长，而糖蛋白 I 的抑制作用不明显，且可增加荷瘤小鼠脾脏重量，但糖蛋白无此作用，推测糖蛋白抑瘤作用显著。通常情况下，多糖具有抗衰老作用与提高免疫功能、清除体内氧自由基及抗脂质过氧化密切相关。一般认为氧自由基的增多是导致机体衰老的主要原因，而超氧物歧化酶 (SOD通过清除氧自由基起到延缓衰老作用。药理研究表明花刺参多糖提取物能显著提高小鼠红细胞 SOD活性，具有延缓衰老作用 J 。龚燕波，方崇波等 在海地瓜多糖的抗衰老生物活性研究中，用海地瓜多糖按生药量喂养小白鼠与对照组用生理盐水喂养

9、对比，进行耐缺氧实验、游泳实验及耐高温实验，结果用多糖喂养的小白鼠存活时间均长于对照组，表明海地瓜多糖能延长小白鼠生存时间，3、增强免疫力海参多糖也能提高机体的细胞免疫功能，可改善使用抗癌药物引起的机体免疫功能低下状况。有资料表明，刺参酸性粘多糖能使人的白细胞悬浮物中的E 花环数量增加， EAC花环和 SmIg 的表达，因此谁知它有增强细胞免疫作用。可能是因为它作用于无活性细胞亚群，致使活性的T 细胞增加入抑制细胞数量也就增加，从而抑制了 B 细胞活化和 SmIg表达。玉足海参多糖能明显增加小鼠免疫器官脾脏的重量，促进机体对血中碳粒的吞噬速度，明显提高机体单核一巨噬细胞系统的吞噬功能，是一种作

10、用较强的免疫促进剂，可用于肿瘤病人的辅助治疗。二色桌片参经双酶水解、乙醇沉淀等步骤从干参体内分离得到均一多糖纯品pmi-1。经化学反应测定和波谱数据分析，确定pmi-1 是一种由 L- 岩藻糖基和 L- 岩藻糖基 -4- 硫酸酯构成的直链均一多糖。它能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，显著增加脾淋巴细胞产生 IL-2 的水平，增强小鼠迟发性超敏反应（ DTH），增加脾、胸腺指数，增强细胞免疫，具有较强免疫活性。4、抗凝血作用我国学者樊绘曾采用酶水解、乙醇沉淀、氧化脱色、二乙氨乙基纤维素分离等方法，从刺参体壁中提取得到刺参多糖得主要有效成分刺参酸性粘多糖(stichopus japonicus acidi

11、c mucopoly-sacccharide，简称 Sjamp）。国内外有关研究表明海参中酸性粘多糖基本上由氨基己糖、己糖醛酸、岩藻糖及硫酸基组成，四者的分子比是1:1:1:4，平均分子量为55000。也有测得相对分子量为50000。早期报道表明刺参提取液有抗凝血作用，但刺参体壁酸性粘多糖在体外有明显的抑制血小板解聚作用，由于它使血小板聚集性增高，产生血小板自发性聚集，在血循环中的血小板聚集体不能通过脏器和组织中的毛细血管而被扣下出现血小板减少。药理研究表明，家兔注射 Sjamp 后，血循环小血小板 量明显减少，而血小板数量减少是由于 Sjamp 使血小板聚集性增高，导致血小板聚集体增多所致。

12、由于血小板的粘附聚集在早期凝血过程中的重要作用，所以血循环中血小板数量的 量消耗造成动物早期凝血功能异常。 Sjamp 对血小板的凝集作用并不引起血小板的活化和代谢，也入发生形态上的变化， 种凝集作用使血小板小能发挥应有的生理活性和功能，从而达到抗凝血和抗血栓的目的。综上所述，海参中所含有效成分 - 粘多糖、蛋白多糖，具有多方面的生物活性，在医学中有广泛的应用前景。随着研究的逐步深入，海参很有可能成为开发新型药物的资源。三、结语我国有 20 余种的海参可供使用，过去人们直接将其应用于医药、食品等方面。而近 40 年来，人们逐渐转向从药效成分、医学及保健作用方面进行分析研究，发现海参含有多糖、多肽及皂苷等多种活性物质，表明多糖的分离和纯化十分复杂，要得到均一的活性多糖组分并不容易。海参多糖的分离纯化方法很多，可以根据不同品种海参的多糖性质选择正确的分离纯化方法，已得到组分纯的多糖。随着人们对海参生物活性物质及其作用研究的不断重视和深入，海参多糖已成为海洋药物及保健品研发中的重要物质，此外，海参多糖因其聚阴离子与水具有较强的亲和力，具有优良的保健功能，可作为化妆品的天然营养添加剂，在美容方面的利用也成为研究发展的重要方向。参考文献1 廖玉麟中国动物志棘皮动物门海参纲M 北京：科学出版社， 19972 王洪涛，付学军，等海参多肽、多糖综合提取工艺条