流动相的调节

1、流动相的调节是搞液相分析最重要的环节， 也是液相水平高低的度量， 每一 种液相都有影响它的主要因素， 抓住主要因素， 问题就容易解决。欢迎大家讨论。 一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！先开个头： 常用的是化学键合相色谱， 分离中性化合较简单， 主要是调节溶 剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出 峰就早。 分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的 作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手，问题就容易解决。液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质， 针对不同化学性质的 单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷 、氨基柱、氰基

2、、苯基太多了， 再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分， 比如：酸性的可以 用十八烷加入酸， 加缓冲盐； 碱性物质可以加缓冲盐。 以个人来讲用离子对的形 式较多，并且效果也很好。现在分析生物碱是比较难做的。如用反相色谱柱时， 一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变 pH 值，酸性物质将 pH 值调低， 碱性物质将 pH 值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠 用于（碱性药物）一 反相 HPLC 中的溶剂优化：1.首先应调整k'值：强溶剂-20%递减一选择合适的溶液强度，使得 k'在 120（tR: 335min）。一种方法是首先试用一种可能过强

3、的流动相，在后面 的试验中逐渐减小溶剂强度以增大 k'当所有谱峰符合1v k'v 20的范围时， 从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。（观察待分离组分的分离度 ）。（反相色谱一一溶剂极性弱洗脱能力强，组分k '减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k'值符合1v k 'v 20范围的大概溶剂成分。2.改变选择性（Q：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同， 根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。二 离子对 HPLC 中的溶剂优化 : 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分 子的一种色谱技术。 关于离

4、子对色谱的机理， 至今仍不十分明确， 但己提出三种 机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采 用离子对形成机理。 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如 C18 型键合相，流动相为水 溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子 B+ , B+离子由于静电引力， 与带负电的组分离子生成离子对， 故称它为平衡离子或成对离子。 由于离子对具 有疏水性，因而被非极性固定相 （即有机相 ）提取。组分离子的性质不同，它与平 衡离子形成离子对的能力大小不同， 以及离子对的极性不同， 导致各组分离子在 固定相中滞留的时间不同， 因而各离子先后离开色谱柱， 这就是离子对色谱

5、法的 基本原理。 以上这类色谱法称反相离子对色谱法。 能用离子对色谱法分离的样品 种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种 官能团化合物的分离。 可用于生理体液的分析， 如甾族化合物以及体液中药物的 分析。反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1.改变选择性：a改变溶剂种类：改 变溶剂选择性的方法， 类似于键合相色谱所介绍的原则。 选用不同选择性组别的 溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH:组分离子与平衡离子的生 成，离子对的形成，都与流动相的 pH 值密切相关。改变流动相的 pH 可以改变 体系的选择性。流动相的 pH 值应调节到能使不同组分有合适的

6、离解度，而使提 供平衡离子的化合物能完全离解。 要符合这一要求， 只有使提供平衡离子的化合 物在一个很宽的 pH 范围内保持完全离解， 因此，只有强酸盐 （高氯酸盐或烷基磺 酸盐）和强碱盐（季铵盐）才满足此要求。C.系统选择:使用一种有机溶剂（甲醇）；流 动相的其它三种成分为pH=2.5 , pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有 最大浓度（例如：200mM）的离子对试剂的缓冲液（D）。以组合不一的缓冲液（B D）进行七次实验，并变化甲醇（A）量以保持每次实验的k'值范围大致恒定。三 正相 HPLC 中的溶剂优化 溶剂非极性溶剂：正己烷或 FC-113（ 1,1,2三氟-

7、1,1,2三氯乙烷）极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位按正相 HPLC 中谱峰间距效应分类的溶剂取代和定位是正相 HPLC 流动相选择性的主要来源 溶剂强度调节 选择性影响四、梯度洗脱梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使， 已成为高效液相色谱法不可缺少的部 分。所谓梯度洗脱，就是有两种 （或两种以上 ）不同极性的溶剂，在分离过程中按 一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。 梯度期间，强溶剂B（如反相HPLC中的甲醇）的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。 可提高分离度、 缩短分离时间、 降 低最小检测量和提高分

8、离精度。 梯度洗脱对于复杂混合物、 特别是保留值相差较 大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k '范围宽，不能用等度方法简单地处置。1梯度洗脱期间的平均k'值tR=tm(1+k ' )VR=Vm(1+k ' )=Vm+kVs针对做生物碱的朋友：1. 用常规的 ODS 柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重 原因：ODS柱有很多未键合的硅羟基，与 N缔合造成。解决方案：使用 BDS 柱，它是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾 现象！2. 用常规的 SCX 离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动 相的 pH 值大小， Rt 变化大

9、！原因：所谓离子交换柱， 就是阴阳正负离子的交换， 由于流动相的离子浓度 的变化，势必会影响交换平衡！解决方案：流动相用 Buffer 缓冲液！实际上用冰醋酸、三氟乙酸、柠檬酸的也不少酸的作用就是根据pKa调节pH值，一定程度上抑制样品组分的解离 反相色谱法分离弱酸(3< pKaW 7)或弱碱(7< pKa< 8)样品时，通过调 节流动相的 pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的 pH 值越小，组分的 k 值越大，当 pH 值远远小于弱酸 的 pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分

10、析弱酸样品时， 通常在流动相中加入少量弱酸， 常用磷酸 （或乙酸、三氯乙酸、 1%的甲酸、硫酸、 50mmol/L 磷酸盐缓冲液和 1%醋酸溶液） 作用 可以抑制溶质的离子化 ,获对称的 色谱峰； 分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用 50mmol/L 磷酸 盐缓冲液和或 30mmol/L 三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用， 减 轻或消除峰拖尾现象。 所以在这种情况下有机胺 （如三乙胺） 又称为减尾剂或除 尾剂。3建立方法时，应考虑下列事项：流动相首选甲醇 -水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药 物，流动相的 pH 值应为 7

11、8；如为酸性药物，流动相的 pH 值应为 34。你是可以通过多种办法测定流动相和样品溶液的 pH 值。随着柱填料的快速 发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大， 现已应用于某些无机样品或易解离样品 的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。但需 要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5 （28）,太高的pH值会使 硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.510 范围操作。分离方式是按固定相的分离机理分类的， 选定了固定相 （色谱柱） 基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不 同，也可

12、能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照下图:高的缓冲盐浓度有较高的缓冲容量， 但是在有机相多的情况下容易析出，高溶解 度的钾盐要比钠盐有优势。一般的钾盐溶解度要比钠盐大的，但是钾盐要贵一点。 磷酸二氢铵嘛就是2个缓冲盐放一起了。缓冲能力、范围更好了，不过铵不稳定。 这种体系的流动相不易长时间放置。最好一天一换。加缓冲盐的目的究竟是什么，在反相液相色谱分析中，流动相的 PH值一般在2-7之间，当被分析物在反相 条件下可离解，或样品的PH值在2-7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下 可离解的化合物一般都有氨基和羧基， 他们的Pka在1- 11之间，选择正确的缓 冲液PH值可保证可离解的官

13、能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形 式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。 选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰， 捡出限，以及获得稳定的保 留时间十分重要。PH 值一般在 2-7的范围，还是要固定的调到某个值？ PH 值是一个固定值！1、变化 PH 值可以影响出峰保留时间2、影响方法的重现性3、在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的 Pka,高于或低于Pka两 个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。溶液 PH值高于或低于Pka两个 单位，化合物中 99以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的 尖锐的峰 .因此最好是固定 P

14、H 值新买的柱子要老化一下才能用的色谱柱老化： 在开始分析工作以前， 柱子必须经过正确的老化。 一个没有正确老化的柱子 可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。A 在反相条件下老化要老化这类柱子， 首先要使用乙腈或者甲醇淋洗， 然后你选用的洗脱液进行 平衡。在发货以前， 每根柱子都已经测试过并进行了老化。 因此没有必要在第一次 使用时用水冲洗。如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂） ，建 议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。 缓冲冲洗应当首先以 低流速进行，最后再使用正常流速。B 在正相条件下老化柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。 柱子的干燥（激活