丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的进一步研究

1、丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的进一步研究    摘要：为进一步研究外周血单个核细胞(PBMC)感染丙型肝炎病毒(HCV)的状况。用逆转录 聚合酶链反应(RT-PCR)、地高辛标记 HCV探针作原位杂交和链酶亲和素-生物素 (SABC)作 免疫组化三项技术，检测血清和 PBMC中的 HCV RNA和HCV NS5抗原。结果显示RT-PCR检 测的20例慢性丙型肝炎患者，除去4例接受干扰素治疗者，余16例中有14例 (87.5%) 血清 HCV RNA阳性，2例血清 HCV RNA阴性者的 PBMC-HCV RNA阳性。对 RT-PCR检测的 9 例 P

2、BMC-HCV RNA阳性患者，进一步用原位杂交和免疫组化技术，分别检测 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原。显示这几种方法的检测结果是基本一致的，呈正相关关系。患者的 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原呈散在颗粒状或弥漫分布，主要位于胞浆中, HCV NS 5抗原还分布于胞膜上。证实HCV可以感染 PBMC，并在其中复制，复制部位在胞浆。 关键词：丙型肝炎病毒；核糖核酸；抗原；外周血单个核细胞中图法分类号：R373.2，Q522，R392.11Further Study on Infection of Peripheral Blood Mononuclear

3、Cells by Hepatitis C VirusAbstract：To further study the infection of hepatitis C virus(H CV) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), HCV RNA and HCV NS5 antigen w ere detected by RT-PCR, in situ hybridization with digoxin-labled HCV nucleotide probe and str ep atadivin-biotin enzyme complex a

4、ssay (SABC) in 20 patients with chronic hepati tis C. The results showed that among the 20 patients with chronic hepatitis C un dergoing RT-PCR, 14 cases (87.5 %) out of 16 cases were positive for serum HCV RNA and the remaining 2 cases with negative serum HCV RNA were positive for PBMC -HCV RNA exc

5、ept 4 patients treated with interferon were negative for HCV. H CV RNA and HCV NS5 antigen in PBMC were further tested by in situ hybridization an d SABC in 9 patients who were HCV RNA positive in PBMC by RT-PCR. The results o btained from the three different methods was similar and showed a positiv

6、e corre lation. HCV RNA and HCV NS5 signals in PBMC were granularly or diffusely distri buted in cytoplasm. Furthermore, HCV NS5 signal also appeared on the membrane of PBMC. The present data showed that HCV marks determined by RT-PCR were credibl e and confirmed that HCV not only could infect PBMC,

7、 but also could be replicate d in PBMC cytoplasm.Key words：hepatitis C virus;RNA, antigen;peripheral blood m ononuclear cells近年应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，成功检测出外周血单个核细胞( PBMC )中的丙 型肝炎病毒核糖核酸( HCV RNA )。认为丙型肝炎病毒(HCV)可以感染外周血单个核细胞，并 提出这可能与 HCV的致病机理及丙型肝炎慢性化有密切关系1,2。但此项技术存 在假阳性和假阴性的可能，使得上述结论受到质疑。鉴于此，我们采用RT-PCR、地高

8、辛 标记HCV探针作原位杂交和链酶亲和素-生物素( SABC )免疫组化三项技术，同时检测2 0例慢性丙型肝炎患者血清和 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原，以便进一步了解 HCV 感染PBMC的状况，并对不同方法的检测结果进行比较分析。1材料与方法1.1病例来源20例慢性丙型肝炎患者为本院 1996年10月至1997年10月住院或门诊病人，男性13例，女 性7例，年龄在1465岁平均(42.3±18.0)岁。所有患者血清 HCV RNA均阳性，且肝 功能检查反复异常，病程在半年以上。甲、乙、戊型肝炎病毒感染指标均阴性。其中4例患 者于近期接受过干扰素的抗病毒治疗，干

9、扰素隔日300万单位，皮下注射，疗程3至6 个月不等。正常对照组15例健康人，男性 9例，女性6例，年龄在1562岁平均（40.5± 16.6)岁 。1.2方法1.2.1RT-PCR检测血清和 PBMC中的 HCV RNA：检测HCV RNA的RT-PCR试剂盒系浙江温 州伊利康生物技术有限公司产品。1.2.2原位杂交检测 PBMC中的HCV RNA：标本制备：取实验对象外周静脉抗凝血3 ml，缓慢加在等量淋巴细胞分离液上，离心 分离出 PBMC，再用 Hank's液离心洗涤 2次，然后用 RPMI-1640液将其制备成0.5×106 的细胞悬液，取 50 l滴片，

10、晾干后用多聚甲醛固定，最后置20冰箱备用。HCV探针：探针序列为：5'GCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGCACTCGC，32-mer ，位于HCV基因组5'端高度保守的非编码区，5'端标记有地高辛。探针由北京赛百盛公司合 成并标记。原位杂交：冻存细胞片取出后，用蛋白酶K和甘氨酸进行杂交前的预处理，之后每 细胞片加 20 l含标记探针的杂交液(杂交液含：去离子甲酰胺，硫酸葡聚糖，2×SSC ，1×Denhart's， 400 mg/L鲱鱼精 DNA， HCV探针浓度为1 mg/L)。置43杂交1618 h， 2%正常羊血清室温封

11、闭30 min，加抗地高辛-碱性磷酸酶复合物 ( 1500稀释 ) 37孵 育1 h，洗涤后以 NBT BCIP 37避光显色3 h，最后逐级酒精脱水，封片。对照试验：原位杂交实验中设计地高辛标记对照探针（探针序列为：5'-TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG,32-mer）组， RNA酶处 理组（杂交前先用 20mg/L RNA酶A于37 孵育30min）、探针省略组及健康人对照组。结果判断：原位杂交检测的 HCV RNA阳性信号为紫蓝色，出现紫蓝色信号的细胞即 为阳性细胞。计数 1000个细胞中的阳性细胞数，算出阳性细胞数的百分率。1.3免疫组化检测 PBM

12、C中的HCV NS5抗原抗NS5单克隆抗体购自北京医科大学肝病研究所。SABC试剂盒系武汉博士德生物工程 公司产品。操作按说明书进行。免疫组化实验中设计了替代、空白和正常人对照。结果判断 除阳性信号着色为棕黄色外，余同原位杂交。2结果2.1RT-PCR检测的 HCV RNA结果可见20例慢性丙型肝炎患者中， 4例接受抗病毒治疗患者的血清和 PBMC中 HCV RNA全部阴 性。除去这4例患者后，余16例患者中有14例（87.5%）血清 HCV RNA阳性， 9例（56.2% ）PBMC-HCV RNA阳性。2例血清 HCV RNA阴性的患者(病例8和病例13), RT-PCR和原位杂 交检测均

13、证实其PBMC-HCV RNA阳性。2.3三种不同方法检测的 PBMC-HCV RNA的结果比较 原位杂交检测的HCV RNA阳性细胞中，可见紫蓝色颗粒状着色，呈散在或弥漫状分布， 主要位于胞浆中。20例慢性丙型肝炎患者中，有8例(40.0%)PBMC-HCV RNA阳性，阳性细胞 的比例个体差异较大，从0.1%到2.0%，平均0.7%(表1）。表1不同方法检测丙型肝炎病毒标记物的结果分析 病例序号 血清HCV RNA(RT-PCR)  外周血单个核细胞 HCV RNA(RT-PCR) HC V RNA(原位杂交) NS5(免疫组化) 1 (1.0%) (1.0%) 3 (

14、2.0%) (3.0%) 5 (0.8%) (0.6%) 8 (0.4%) (0.1%) 13 (0.1%) 14 (0.2%) 18 19 (0.6%) (0.6%) 20 (0.6%) (0.8%) 6 11 12 17 2 4 7 9 10 15 16 括号内为阳性细胞百分率免疫组化检测的 PBMC-HCV NS5阳性细胞呈棕黄色颗粒状着色，呈散在或弥漫状分 布，胞浆和胞膜上均有分布。20例患者中有 6例(30.0 %)阳性，阳性细胞的比例从 0.1% 到3.0%，平均为 1.0%（表1）。由表1可见，9例 RT-PCR检测的 PBMC-HCV RNA阳性者中，原位杂交检测的 PBMC-

15、 HCV RNA阳性者为8例，两者符合率达 95%，无明显差异(P0.05)。将原位杂交检测 的 PBMC-HCV RNA及免疫组化检测的 PBMC-HCV NS5抗原作比较时，可见 7例患者完全一 致。HCV NS5抗原阴性的2例患者(病例13和病例14),皆为原位杂交检测的 PBMC-HCV RNA 阳性细胞百分率最低者。经等级相关分析，显示这两种方法的检测结果呈正相关 (r=0 .946, P0.001)。2.3原位杂交和免疫组化的特异性原位杂交和免疫组化对照实验的结果均呈阴性，说明本实验所采用的方法具有可靠的特异性 。3讨论本实验用临床常用的 RT-PCR检测血清和 PBMC的 HCV

16、 RNA。结果显示慢性丙型肝炎患者 中，血清 HCV RNA阳性率仅达87.5%，进一步检测PBMC-HCV RNA，可使诊断符合率达 100% 。对RT-PCR检测的 9例 PBMC-HCV RNA阳性患者，进一步用原位杂交和免疫组化技术，分 别检测PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原。显示这几种方法的检测结果是基本一致的，呈 正相关关系。证实 RT-PCR检测 HCV RNA的结果是基本可信的。我们曾用RT-PCR证实 HCV可以感染丙型肝炎患者的PBMC，并在PBMC中检测出负链H CV RNA，病情活动者，PBMC中负链HCV RNA的检出率越高。提示 HCV不仅可以感染

17、 PBMC， 而且可在其中复制3。本文原位杂交和免疫组化检测 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原的结果显示，二者均出现在胞浆中， HCV NS5抗原还表达于胞膜上，而且二者 的检测结果呈正相关。进一步证实HCV可以感染 PBMC，并可在其中复制，复制的部位在胞浆 中。本文部分患者血清 HCV RNA阴性而 PBMC-HCV RNA阳性的结果再次提示，血清 HCV RNA 阴性，并不能完全排除 HCV感染，也不一定表明感染的清除。检测 PBMC-HCV RNA对于临床 判断病情和抗病毒疗效的考核具有重要意义。与Sansonno4所获结果相似，本文原位杂交和免疫组化检测的 PBMC

18、-HCV RN A及PBMC-HCV NS5抗原阳性细胞百分率也较低。这有几种可能：PBMC的HCV感染率很低 ；HCV感染的淋巴细胞亚群的差异；检测方法或试剂的敏感性差异。迄今 HCV感染慢性化的致病机理仍不清楚。 HCV感染 PBMC后不易清除，隐藏在 PBMC中 的HCV可能是 HCV感染复发和慢性化的原因之一。此外，我们还发现 HCV感染 PBMC后，可引 起CD4+/CD8+比例失调(另文发表)。这种 HCV感染 PBMC引起 T淋巴细胞亚群的变化，可 能导致免疫功能失调，从而不能有效地清除病毒5，可能是另一重要原因。参考文献1，Taliani G, Badolato L, Lecce R et al. Hepatitis C virus RN A in peripheral blood mononuclear cells: relation with response to interferon treatment. J Med Virol, 1995, 47:162，Kao T H, Chen P J, Lai M Y et al. Positive and negative str and at hepatitis C virus RNA sequences in peripheral blood mononuclear cells in patients w