棉花(Gossypiumhirsutum)DREBCBF基因的筛选鉴定及其在植物抗逆应答中的功能研究

1、棉花(Gossypiumhirsutum)DREB/CBFS因的筛选鉴定及其在植物抗逆应答中的功能研究棉花是世界上最重要的经济作物之一,但随着全球生态环境的日益恶化,干旱、盐渍、低温等非生物胁迫常常对棉花生产造成重大损失,是限制棉花产量增加的主要环境因素。为解决这一农业问题,通过基因工程手段,发掘棉花抗逆相关的重要功能基因,并将这些基因导入植物基因组,进而获得抗逆新品种,是应对逆境胁迫,提高棉花产量的最为有效途径之一。研究表明,过量表达特定的胁迫应答转录因子,可以调控下游多个抗逆功能基因的表达,对于提高作物抗逆性具有重要作用。DREB/CBF(DehydrationResponsiveElem

2、entBindingProtein/C-repeatBindingFactor)是一类重要的植物转录因子,在植物响应逆境胁迫应答以及抗逆过程中扮演重要角色。与拟南芥和水稻等传统模式植物相比,棉花抗逆性转录因子的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此，筛选和鉴定棉花抗逆相关的DREB/CBES因，分析揭示其抗逆分子机制,通过基因工程手段来改良提高棉花的抗逆性,对于我国棉花生产具有重要意义。本文运用生物信息学方法对棉花DREB/CB基因进行筛选鉴定，分析这些基因的结构特点、进化关系以及干旱诱导表达模式,通过过量表达方法对棉花CBF2和CBF3S因在植物非生物胁迫应答过程中的功能及作用机制进行了研究，获

3、得了如下主要结果：1.参与非生物胁迫应答棉花DREB/CB基因的分离、鉴定和表达分析通过Blast同源搜索，共鉴定出21个棉花CBW因家族成员，从基因结构和进化等方面进行了分析。结果表明，与拟南芥和水稻CBF基因一样，棉花CBF家族基因均含有一段由58个氨基酸组成的保守的AP2/EREBP吉构域。根据进化关系，将所分离鉴定的21个棉花CB现因划分为4个亚族（I-IV）同时，利用半定量RT-PCRffi荧光定量RT-PC时法又t这21个棉花CBF基因在冷、干旱（甘露醇处理）和盐胁迫处理下的表达模式进行了分析。实验结果表明,在受到冷胁迫诱导时,有12个基因的表达量显著上调；在受到干旱胁迫诱导时,有

4、10个基因的表达量显著上调；而在受到盐胁迫胁迫诱导时,则有11个基因表达量显著上调。但每个基因在受到胁迫诱导后的表达时间和表达量均有所不同。2. GhCBF3基因结构和表达分析根据棉花CBFS因逆境胁迫诱导表达模式,从候选基因中筛选了一个受干旱和盐胁迫诱导高表达的基因。序列分析表明,该基因无内含子,开放阅读框为462bp,编码153个氨基酸,我们将其命名为3hCBF3（GeneBank号为KP780186进一步的表达分析结果表明经NaCl、甘露醇和ABA处理后,GhCBF3s因表达量均显著上升，且在棉花子叶和根中该基因表达量最高。对GhCBF3s白亚细胞定位分析表明，GhCBF3:eGFPt色

5、荧光信号主要在细胞核中检测到，说明GhCBF3T能是在细胞核中发挥调控功能。但自激活分析表明GhCBF3s白不具有自激活现象。在GhCBF3s因的启动子序列区域含有多个响应ABA言号的顺式作用元件AREB利用GUS艮告基因研究该启动子的表达活性。GUSS性的组织化学分析结果显示，在正常条件下，在GhCBFJg动子才5制下，转基因拟南芥子叶、叶片的叶脉、根尖，尤其在气孔保卫细胞中都检测到GUSJ号。拟南芥幼苗经非生物胁迫处理后，GUS活性增强，表明GhCBF昭动子能响应高盐、干旱和ABA等外界环境信号。3. GhCBF3基因的抗逆功能分析为研究GhCBF塞因的功能，构建了GhCBF3过量表达载体

6、并转化了拟南芥,筛选获得转基因植株。分别选取这些外源基因在拟南芥中表达量高、中、低的株系做表型分析及功能研究。结果显示过量表达GhCBF3S因的转基因植株在生长表型上与野生型对照植株没有明显差异。当受到干旱和盐胁迫处理后，转GhCBF3S因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性比对照显著增强。另外,GhCBF3a量表达转基因植株显著提高了对外源ABA勺敏感性。在受到高盐、干旱和ABA处理后,转基因拟南芥中与干旱胁迫和ABAffi关的RD29ACOR15ARD22sP5CSB因表达量显著上调。GhCBF38因除了能提高转基因拟南芥种子对ABAS感性外，同时也会促进转基因拟南芥叶片中气孔关闭。另外，当受到外

7、源ABA处理后，转基因拟南芥中AREB1/ABF建口AREB2/ABF塞因的表达量显著高于野生型，这说明GhCBF3SI3能够调控转基因拟南芥中AREB1/ABF冬口AREB2/ABF驱因的表达，进而影响转基因拟南芥气孔对ABA的敏感性，加速气孔关闭，从而提高植株抗旱能力。上述结果表明GhCBF参与了对ABA的应答。4.GhCBF2基因的表达和抗逆功能分析从棉花中鉴定了另外一个CBF基因，命名为GhCBF2该基因编码一段长度为226个氨基酸的蛋白质序列。GhCBF含有1个典型的由58个氨基酸组成的AP2/EREBP域，该结构域可形成3个0-折叠和1个a-螺旋结构。分析表明，GhCBF洲因在根和

8、叶片组织中表达量最高。经NaCl和甘露醇处理后,GhCBF2s因在棉花子叶、根和叶片中的表达量均显著增加；当受到ABAM理后GhCBF2s因在各组织中的表达量显著增加，表明GhCBF2S因在棉花应对干旱和盐胁迫时可能发挥重要的调控作用。GhCBF察白亚细胞定位分析表明，GhCBF2:eGFP录色荧光信号主要集中在细胞核中,说明GhCBFg白定位在细胞核中。为分析GhCBF流因的功能,分别从GhCBF2专基因拟南芥株系中选择了L6,L11和L21,来分别代表高、中和低3种目的基因表达量不同的转基因株系,用于基因功能分析。结果证实GhCBF2s因高表达转基因株系具有最强的抗盐、抗旱能力，说明GhCBF2S因在增强转基因植物种子和幼苗时期的耐盐和抗旱性方面发挥重要作用。本实验中对GhCBF2专基因拟南芥和野生型植株中游离脯氨酸、相对含水量和叶绿体色素的含量等一系列生理指标的测定结果显示,当转基因拟南芥和野生型经NaCl溶液处理和干旱处理后,野生型拟南芥叶片