雄黄抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究

1、雄黄抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究    作者：尹伶 濮德敏 吴青 郭孝鹏    【摘要】 目的： 体外研究中药雄黄主要成分As4S4对子宫颈癌细胞株Hela细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法：以As4S4不同浓度 (7.5、15、30、60mg/L)，分12h,24h,36h,48h,60h处理Hela细胞,用光镜观察细胞变化；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率；流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率；用DNA梯状电泳(DNA ladder)检测凋亡的发生。结果：不同浓度 (7.5、15、30、

2、60 mg/L )的As4S4处理的Hela细胞,细胞增殖受到抑制，作用呈明显的时效和量效关系，差异有非常显著性(P<0.01)；As4S4诱导Hela 细胞的凋亡率为(8.13±1.13)%(62.36 ±4.42)%,与对照组比较(2.84±1.88)%,差异有极显著性(P<0.01),并呈浓度依赖性；DNA ladder呈梯状条带。结论： 雄黄体外对宫颈癌细胞株Hela细胞具有增殖抑制和促进凋亡作用。    【关键词】 As4S4； 增殖抑制; Hela细胞; 凋亡 祖国的传统中药雄黄是砷剂的一种，主要成分

3、为硫化砷(As4S4)，在我国传统医学中有悠久的应用历史。近来中药砷剂(雄黄、砒霜)在治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)方面取得了明显的疗效13，发现中药砷剂具有抗肿瘤作用，其主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。目前对氧化砷（砒霜）的研究较为广泛,而对硫化砷雄黄研究的报道较少，对妇科肿瘤的作用未见报道。    子宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,由于近年来性传播疾病的蔓延,宫颈癌的发病率又有上升和年轻化趋势。目前治疗宫颈癌以手术为主, 但根治术的5年生存率较低,子宫颈癌对放疗的敏感性具有个体差异,且放疗后易出现局部转移和复发, 因此寻找有效的子宫颈癌化疗药物具有重

4、要意义。本研究对雄黄的主要成分硫化砷对人子宫颈癌Hela细胞体外作用进行了探讨,旨在为寻找新的有效治疗子宫颈癌的药物提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料    人宫颈癌Hela细胞株购自上海科学院生物细胞研究所。高纯度雄黄As4S4（>95%）由西安交通大学血液病研究中心提纯惠赠。5%四甲基偶氮唑蓝(MTT 溶液,上海华美生物工程公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂、DNA Ladder试剂盒(美国Sigma公司);胰蛋白酶、RMPI 1640 培养基、小牛血清(武汉凌飞生物公司)。 1.2 细胞形态观察  &

5、#160; 每瓶(25cm2) 接种1.5×105细胞,24后加入不同浓度(7.5、15、30、60mg/L)的As4S4处理,每天用倒置显微镜观察记录实验组和对照组的细胞形态变化。 1.3 MTT 检测    以每孔1×105 个Hela细胞接种于96孔培养板, 分为空白组(调零)、As4S4实验组(7.5、15、30、60 mg/L mg/L)和对照组(不加药物的细胞)，分别培养12h,24h,36h,48h,60h后加入MTT液，再培养4h，吸弃孔中的培养上清,每孔加入150l DMSO, 混匀10min ,在酶联免疫

6、检测分析仪570nm处测定各孔吸光度值(A), 抑制率(%)=(1- 实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。重复3次取平均值。 1.4 DNA梯状电泳(DNA ladder)    培养细胞离心换液后,经冷PBS洗2遍,按照试剂盒说明提取DNA,并溶于无DNA酶的TE液中,20V电泳4h琼脂糖凝胶电泳后,KODAK DNA analysis 2.0 凝胶成像系统分析。 1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率    用Annexin?V?FITC及PI双标流式细胞仪检测细胞凋亡,分为实验组和阴性对照组。实验

7、组分别加入终浓度为7.5、15、30、60 mg/L 的As4S4作用24h，未加药组为对照组，用70%乙醇4固定24h，PBS缓冲液洗去固定液，离心去上清。用缓冲液37孵育60 min，195l细胞悬液加5l Annexin?V?FITC，混匀，室温10min。用缓冲液洗涤细胞1次，在190l缓冲液中重悬，然后再加10l(含20g)碘化丙啶，上流式细胞仪检测。 1.6 统计分析    采用SPSS11.5统计软件包进行t检验分析，ANOVA 分析。 2 结果 2.1 光镜下Hela细胞凋亡的形态学变化    正常

8、生长的Hela细胞为上皮样细胞，粘附生长于培养瓶壁上，细胞平坦。    As4S4处理Hela细胞24h, 7.5 mg/L处理组可见细胞间有间隙，细胞形态变化不明显；15 mg/L处理组可见细胞变圆,体积缩小；30 mg/L处理组可见细胞间距离增大，圆细胞增多，细胞皱缩，核固缩出现,核颜色加深,折光性增强；60mg/L处理组可见细胞脱落悬浮在培养基中。随着As4S4作用时间增加，以上变化更明显，至60h，细胞坏死。对照组细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞质饱满,生长舒展,相邻细胞生长融合成片。    2.2 As4S4

9、 对Hela细胞增殖的影响    As4S4以时间剂量依赖性方式抑制Hela细胞增殖, 12h、24h、36h、48h、60h后，细胞抑制率分别如下：7.5mg/L为(23.58±4.65)%、 (30.92±3.79)%、(35.57±4.21)%、(40.18±4.25)%、(46.31±1.90)%；15mg/L为(28.71±5.64)%、(37.58±5.81)%、(46.58±3.92)%、(51.77±1.28)%、(54.22±2.25)%

10、；30mg/L为(40.28±0.67)%、(47.99±4.53)%、(54.82±4.47)%、(61.61±1.81)%、(64.01±4.00)%；60mg/L为(47.27±0.93)%、(58.29±3.83)%、(65.57±3.73)%、(71.88±4.05)%、(79.75±6.14)%，各组差异有显著性意义(P<0.01)。 2.3 DNA梯状电泳(DNA ladder)    以不同浓度（7.5、15、30、60mg/L） A

11、s4S4作用Hela细胞24h,提取 DNA经低压琼脂糖凝胶电泳后,呈梯状条带,见图1。 1 对照组； 2 7.5 mg/L As4S4； 3 15 mg/L As4S4； 4 30 mg/L As4S4； 5 60mg/L As4S4 图1 不同浓度As4S4处理后Hela细胞的DNA ladder（略） 2.4 As4S4对Hela细胞凋亡的影响    表1 不同浓度As4S4作用24h对Hela细胞凋亡的影响（略） 注：* P<0.01。    Hela细胞经不同浓度（7.5、15、30、60mg/L）

12、 As4S4作用24h，随着As4S4浓度提高,早期凋亡率逐渐增加,其凋亡率分别为(8.13±1.13)%、(29.58±2.51) %、(46.24 ±3.92)%、(62.36 ±4.42)%,与对照组 (2.84±1.88)% 比较,不同浓度As4S4均能明显诱导细胞凋亡，后3组浓度诱导凋亡差异有极显著性 (P<0.01),并呈浓度依赖性，见表1。 3 讨论    肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病,也是凋亡异常的疾病。已证实细胞凋亡减少或不凋亡等可引起肿瘤的发生,故细胞凋亡普遍存在于大多数肿瘤组

13、织中,与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系3,因此诱导肿瘤细胞凋亡已成为近来肿瘤治疗的重点4。    宫颈癌的发生发展也与肿瘤细胞的恶性增殖和肿瘤细胞的凋亡减少有关,近年来随着对细胞凋亡研究的深入和发展,人们逐渐认识到诱导细胞凋亡是治疗肿瘤性疾病的一种有效的方法和手段，许多抗肿瘤药物都是通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到杀死肿瘤细胞的目的4。含砷中药逐渐得到大家的注目,三氧化二砷在血液系统肿瘤方面疗效显著，其治疗范围逐渐从少数白血病向其他白血病及实体肿瘤扩展。但三氧化二砷为剧毒性药物,毒副作用较大;而同属砷制剂的雄黄的毒性要比三氧化二砷低得多,其价值备受关注，有

14、关雄黄诱导细胞凋亡及机制的研究有所报道5,6。现研究较多的是雄黄能抑制不同类型恶性血液病细胞增殖和诱导凋亡，对实体肿瘤细胞有类似作用。因此抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡是雄黄抗肿瘤作用的一种比较明确的机制。陈思宇, 张晨7，8等研究发现雄黄能抑制血液病细胞的增殖和诱导其凋亡，其作用机制与雄黄上调Bax，下调Bcl?2和P?gP，增加细胞膜HSP70蛋白表达有关。邹春芳，张晨9，10等用雄黄分别对实体瘤肺腺癌SPC?A?1、肝癌细胞系BEL?7402进行干预，发现雄黄能抑制上述癌细胞的增殖，阻滞细胞周期。    本实验通过细胞增殖抑制实验研究雄黄主要成分硫化砷

15、（As4S4）抗肿瘤作用,表明其能有效抑制Hela细胞增殖,并能诱导其发生凋亡，且呈明显的量效关系和时间依赖性。 FCM显示, 硫化砷处理后凋亡细胞所占比例明显增高,这与文献报道硫化砷诱导肺腺癌细胞、肝癌细胞BEL?7402凋亡一致9，10。以不同浓度As4S4作用Hela细胞24h,提取 DNA经低压琼脂糖凝胶电泳后,呈梯状条带。因此，通过体外研究初步显示，雄黄对人宫颈癌Hela细胞具有增殖抑制作用和促进细胞凋亡作用，且呈明显的量效关系和时间依赖性。雄黄如何抑制肿瘤细胞和诱导其凋亡的，其作用机制有待进一步探讨。本实验可为雄黄抗实体肿瘤的研究，为进一步开发雄黄的药用价值提供一定的实验依据。 【

16、参考文献】 1 Chen SY, Li XM, Liu SX. Over view of the advance in the research of traditional chinese medicine containing arsenic for the treatment of malignant hematologic disease. China Journal of Chinese Materia Medica , 2000，25(8):454.2 Wang ZY. Arsenic compound sasantic cancer agents. Cancer Chemothe

17、r Pharmacol, 2001，48(Suppl1):S72S76.3 Chen Z, Chen GQ, Shen ZX, et al. Treatment of acute promyelo cytic leukemia with arsenic compounds: In vitro and in vivo studies. Semin Hematol, 2001，38(1):2636.4 粟俭,张礼和.药物诱导的肿瘤细胞凋亡研究进展.国外医学,肿瘤学分册,1995,22(1):710.5 刘延方,江滨,陆道培.硫化砷诱导4细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究.中华血液学杂志,2000,21(12):647648.6 钟璐,陈芳源,韩洁英,等.