结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

1、结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响         11-03-25 11:49:00     编辑：studa20                 作者：苟丽霞，吴国球，范晓波，刘朝朝，吴宏斌【摘要】  目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的小鼠肺

2、纤维化模型各阶段的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数及纤维化程度的影响。方法：昆明小鼠36只，随机分为对照组、模型组和ScFv组，每组12只;后2组麻醉后气管内滴入博莱霉素制备模型，滴药后第2天开始尾静脉分别注入生理盐水或ScFv(4 mg·kg-1)，3次·周-1，对照组给予等量的生理盐水;气管内滴药后第7、14、28天分3批处死小鼠，收集左肺BALF，进行炎症细胞计数和分类;肺组织HE染色后观察肺纤维化程度。结果：(1) 第7天模型组有明显的肺泡炎，ScFv组小鼠肺泡炎症病变轻微;第28天模型组出现肺纤维化，ScFv组纤维化程度明显低于模型组(P<0.05)

3、;(2) 第7、14天模型组小鼠BALF中细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞均明显高于对照组(P<0.05)，ScFv组明显低于模型组(P<0.05)。结论：CTGF ScFv可减少肺纤维化模型BALF中的炎症细胞，减缓肺纤维化的发生发展。 【关键词】  结缔组织生长因子单链抗体; 肺纤维化; 支气管肺泡灌洗液; 炎症细胞; 小鼠Abstract Objective: To investigate the effects of the singlechain variable fragment of antibody(ScFv) against connective

4、 tissue growth factor(CTGF) on the inflammatory cells in bronchoalreolar lavage fluid(BALF) and fibrosis dgree of pulmonary fibrosis model induced by bleomycin. Methods: Thirty six male Kunming mice were randomly divided into three groups: the control group, the model group and the ScFv group. The l

5、atter two groups were injected with bleomycin via trachea(5 mg·kg-1) and the control injected with saline. Then, the ScFv group were injected ScFv via intravenous(4 mg·kg-1), and the others were injected saline via intravenous. At the 7th, 14th and 28th day after intratrachealed, BALF were

6、 collected and pulmonary tissue was used to HE stain. 4 mice in each group were sacrificed administration to collect samples，which were used to count and classify cells. The fibrosis degree in the right pulmonary lobe was observed by light microscope. Results: (1) Apparent alveolitis appeared in the

7、 model group, while it was much slight in the ScFv group at the 7th day. At the 28th day, both of the groups appeared pulmonary fibrosis, but the fibrosis of ScFv group seemed in a earlier stage(P<0.05). (2) At the 7th and 14th day, the number of cell and the propotion of neutrophils in BALF in t

8、he model group were higher than those in the control group(P<0.05). The number of cells and the propotion of neutrophils in BALF in the ScFv group were lower than those in the model group(P<0.05). Conclusion: ScFv can decrease the number of inflammatory cells in BALF of the pulmonary fibrosis

9、model induced by bleomycin, which relieve the airsacculitis of fibrosis of lung.Key words singlechain variable fragment of antibody against connective tissue growth factor; pulmonary fibrosis; bronchoalveolar lavage fluid; inflammatory cells; mice肺纤维化是肺损伤后常见的反应和并发症，尽管致病因素不同，但其主要的病理改变为弥漫性肺泡炎症、肺成纤维细胞灶

10、的形成以及细胞外基质的反复修复和过度沉积1。肺纤维化常以呼吸功能永久丧失为最终结局，目前尚缺乏有效防治手段2。肺纤维化的早期为肺泡炎阶段，大量的炎症细胞和肺组织细胞分泌多种细胞因子和酶，构成一个相互交错的网络，参与肺纤维化的形成，逐渐发展为弥漫性的肺纤维化，转化生长因子(transforming growth factor, TGF)1以及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是纤维化发生发展过程中至关重要的细胞因子3-4，在免疫和炎症反应中起重要作用。本实验用博莱霉素气管内滴入诱发小鼠肺纤维化模型，应用CTGF单链抗体(ScFv)进行干

11、预，观察肺纤维化模型小鼠的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的炎性细胞总数及各种炎性细胞计数的变化。1 材料与方法1.1 材料昆明雄性小鼠36只，体质量(24±2) g，购于南通大学医学院实验动物中心;盐酸博莱霉素(15 mg·支-1)，日本化药株式会社生产;CTGF ScFv，本实验室利用基因工程技术纯化制备。1.2 实验方法1.2.1 动物分组及肺纤维化动物模型的建立 36只小鼠随机分为对照组、模型组和ScFv组,每组12只。小鼠称量体质量后，10%乌拉坦0.20.3 ml腹腔注射麻醉，仰卧固定在实验台上，颈部去毛

12、后乙醇消毒，切开皮肤，钝性分离，逐层暴露气管，将微量注射器针头经两气管软骨环之间朝向心端刺入气管，将生理盐水(对照组)或配好的博莱霉素溶液(模型组与ScFv组)以5 mg·kg-1(约50 l)缓慢注入小鼠肺内，注入液体后迅速将小鼠直立、旋转，使药液在肺内均匀分布，缝合颈部皮肤，小鼠清醒后尾静脉注射200 l生理盐水(对照组和模型组)或ScFv(ScFv组)(4 mg·kg-1)，3次·周-1。1.2.2 标本采集 各组小鼠于建模后第7、14、28天分批处理，每批每组随机抽出4只，称质量后10%乌拉坦腹腔注射麻醉，切开颈部皮肤逐层暴露气管，打开胸廓，结扎右肺，将肺

13、泡灌洗针穿入气管并固定后向左肺注入0.4 ml冷生理盐水，边按摩胸部边回收液体，重复3次，每次重复3遍(总回收率大于灌洗液的80%);取右肺组织-70 保存备用。右下肺4%中性福尔马林固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，4 m厚切片，进行HE染色，光镜下观察肺组织炎症及纤维化情况。肺组织纤维化程度的判定按照Szapiel等5的方法评价。1.2.3 BALF中细胞总数及分类 回收的BALF摇匀后取少许滴在细胞计数板上，光镜下进行细胞计数，然后4 、1 000 r·min-1离心10 min，沉淀物作瑞氏染色，干燥后在油镜下分类，每张玻片数400个细胞中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的个数

14、，计算出以上几种炎症细胞占总细胞的百分比。1.3 统计学处理所有计量资料均以±s表示，两两比较采用两样本均数的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 小鼠一般情况对照组小鼠体质量增加明显，体格健壮，食欲良好，毛发有光泽，善活动;模型组小鼠精神差，瘦弱，毛发灰暗，无光泽，活动少;ScFv组的一般情况介于对照组与模型组之间。2.2 小鼠肺脏大体观察结果各时间点对照组小鼠肺叶轮廓清晰，呈淡粉红色，表面光滑，弹性好，未见肿胀和出血点;第7、14天模型组小鼠肺组织呈暗红色，肿胀，有散在点状出血灶，第28天模型组小鼠肺表面都有不同程度的挛缩变形，表面灰白，可见出血点，表面

15、有较多灰白色小结节，质地较硬，肺体积缩小，肺组织与胸膜部分有粘连，支气管灌洗时肺组织弹性差;第7、14天ScFv组多数小鼠肺脏呈粉红色，未见肿胀，偶见点、片状出血灶，第28天ScFv组少数小鼠肺组织呈苍白色，但表面结节较少，质地较软，肺体积无明显缩小。2.3 各组小鼠肺组织病理标本纤维化程度各组小鼠肺组织病理标本纤维化程度见表1，在各时间点模型组小鼠的肺纤维化程度较重，而ScFv组小鼠的肺纤维化程度较轻。表1 各组小鼠肺组织病理标本纤维化程度(HE染色)     11-03-25 11:49:00     编辑：s

16、tuda202.4 HE染色观察各组小鼠肺组织切片的变化对照组肺泡形态正常，肺泡壁纤细，间质中无炎症细胞浸润;模型组小鼠第7天肺泡间隔水肿，炎症细胞浸润，肺泡腔内有炎性渗出物，第14天肺泡炎程度减轻，肺泡间隔增厚，成纤维细胞增多，病变严重的可见大片的肺实变，第28天肺泡结构异常，可见囊泡状扩张以及弥漫性的纤维化形成;ScFv组与模型组病理变化有着相似的规律，但肺泡炎以及肺纤维化程度都轻于模型组。2.5 小鼠左肺BALF中的炎症细胞总数以及分类2.5.1 炎症细胞总数 各时间点模型组BALF中炎症细胞总数均高于对照组(P<0.01)，与模型组比较ScFv组各时间点的细胞总数明显降低(P&l

17、t;0.01)。见表2。表2 3组小鼠左肺BALF中炎症细胞总数的比较与对照组比较，a P<0.01;与模型组比较，b P<0.012.5.2 细胞分类 第7、14天模型组小鼠BALF中的巨噬细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞计数均明显高于对照组(P<0.05)，使用ScFv干预后各种炎症细胞计数均有所降低(P<0.05);第28天模型组小鼠BALF中淋巴细胞明显高于对照组(P<0.05)，ScFv干预后淋巴细胞计数降低(P<0.05)。见表35。表3 第7天3组小鼠左肺BALF中炎症细胞分类的比表4 第14天3组小鼠BALF中炎症细胞分类的比与对照组比较,a P

18、<0.05;与模型组比较,b P<0.053 讨 论肺纤维化是肺组织的炎性损伤、组织结构破坏以及随后伴有肺间质细胞增生的组织修复过程，肺损伤早期均有肺泡炎表现，这种肺泡炎改变多认为是损伤因子导致肺泡壁毛细血管内皮通透性增加的结果，此期病理表现为血浆蛋白性渗出及巨噬细胞游出5-6。本实验结果显示在博莱霉素诱导的肺纤维化损伤早期，肺泡腔及病变组织有大量的巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的浸润。这些炎症细胞可产生大量的细胞因子，如TGF2、CTGF、肿瘤坏死因子2(TNF2)、干扰素2(IFN2)、白细胞介素24(IL24)和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)等，从而形成复

19、杂的细胞因子网络，调控肺泡上皮细胞和间质成纤维细胞的增殖和凋亡，使细胞外基质的沉积逐渐增多，抑制纤溶系统的激活，最终促使肺纤维化的形成7。在众多细胞因子中，TGF和CTGF是公认的致肺纤维化形成与发展的最重要的细胞因子，而TGF是“开关性”细胞因子，其促纤维化的信号可能通过CTGF向下转导8-9。CTGF是引起结缔组织生长的效应分子和调节多个致纤维化信号传导通路的关键活性分子，与肺纤维化的形成与发展密切相关。目前已证实CTGF能直接诱导肺成纤维细胞的活化、增殖和分泌胞外基质10。研究发现，CTGF在正常小鼠肺组织中几乎不表达，而在模型组小鼠的肺组织中，CTGF蛋白mRNA的表达均明显升高，而且

20、CTGF的表达随着小鼠肺纤维化程度的加重逐渐增高，提示CTGF在肺纤维化的形成过程中起重要作用11。CTGF作用于效应细胞(如成纤维细胞、内皮细胞等)，通过激活不同信号途径分泌大量的TGF和其它细胞因子，这些因子与受体结合后，可进一步促进CTGF的合成和分泌，构成了循环放大效应。因此，抑制其活性可以减少CTGF对Smads和ERK1/2途径及TGF分泌的正反馈激活12。目前，治疗肺纤维化的药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂，不仅疗效不佳且副作用较多2。近年来将拮抗在诱导纤维化过程中起关键作用的TGF2作为治疗或延缓各器官纤维化的靶位，但TGF2作用的靶细胞较多、效应复杂，在抗炎、抑癌等方面是正常

21、机体不可或缺的细胞因子，若过于阻断其表达有可能产生许多难以控制的副作用13，因而限制了以拮抗TGF2的作用为目标的治疗策略。本实验结果表明，在肺纤维化的早期肺泡炎时期，使用CTGF ScFv干预后，可减轻早期肺部炎症反应;ScFv能使小鼠的肺纤维化明显改善;同时没有观察到明显的毒副作用，说明ScFv可能通过拮抗CTGF活性从而减少多种致纤维化细胞因子的合成与分泌，改善细胞因子环境，可减轻早期肺部炎症反应，从而延缓肺纤维化进程。在下一步研究中，我们将进一步检测BALF及血液中引起炎性变化的多种细胞因子水平，获得ScFv拮抗CTGF活性引起细胞因子变化的直接或间接证据，为ScFv的深入研究打下基础

22、。【参考文献】  1 WAJERS D M, CHO H Y, KLEEBERGER S R. Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis: a potential role for Nrf2J. Antioxid Redox Signal, 2008,10(2):321332.2 XU M, DENG B, CHOW Y L, et al. Effects of curcumin in treatment of experimental pulmonary fibrosis:

23、 A comparison with hydrocortisoneJ. J Ethnopharmacol, 2007,112(2):292299.3 甘红英,刘学军.转化生长因子1及其受体在肺纤维化中的作用J.国际呼吸杂志,2006,11(26):860865.4 LWASK A, PARAPURAM S K, SHIW X, et al. Connective tissue growth factor(CTGF, CCN2) gene regulation: a potent clinical biomarker of fibroproliferative disease?J. J Cell Commun Signal, 2