吴琼-03基因与研究方法

1、利用克隆、利用克隆、PCRPCR、分子杂交方法、分子杂交方法研究多元化的基因研究多元化的基因结构基因结构基因 包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。也包括编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。调控基因调控基因 包括调节基因、启动基因和操纵基因。包括调节基因、启动基因和操纵基因。Operon:rDNA, tDNA 操纵子操纵子（operon）？）？ 操纵基因操纵基因（operator）？）？ 调节基因调节基因（regulatory gene）？）？J. Monod与与F. Jacob 70年代由年代由R. J. Roberts和和P. A.

2、Sharp首先报道。首先报道。10S 珠蛋白前体珠蛋白前体RNA以及其以及其15S 珠蛋白珠蛋白mRNA与小鼠与小鼠 珠蛋白基因杂交形成珠蛋白基因杂交形成R环的电镜图环的电镜图卵清蛋白基因及其与卵清蛋白基因及其与mRNA或或cDNA的杂交图的杂交图1978年，年，Gilbert提出内含子、外显子概念。提出内含子、外显子概念。1 在在mRNA加工中改变拼接方式或途径可加工中改变拼接方式或途径可以增加基因片断的利用，使以增加基因片断的利用，使DNA信息储信息储藏量增加藏量增加。2 内含子的存在可能内含子的存在可能有利于进化有利于进化过程。过程。3 控制控制RNA拼接系统可以拼接系统可以调控基因调控

3、基因的表达。的表达。4 内含子的内含子的相对性相对性。TATA TATA AATAAA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 转录 加工 1 4 5 6 7 8 9 polyA LC1mRNA LC3mRNA 2 3 5 6 7 8 9 酵母细胞色素酵母细胞色素b基因的内含子基因的内含子2参与编码成熟酶，成熟参与编码成熟酶，成熟酶又反过来参与内含子酶又反过来参与内含子2的剪接，产生成熟的的剪接，产生成熟的mRNA 插入序列插入序列内含子内含子 间隔区间隔区转录间隔区转录间隔区非转录间隔区非转录间隔区 剪切作用若是通过酶来作用的，酶是剪切作用若是通过酶来作用的，酶是如如何识别何识别RNA上特定位点

4、上特定位点的？的？ 剪切酶有没有剪切酶有没有特异性特异性？不同？不同RNA是否需是否需要不同的酶？要不同的酶？ 切除的切除的RNA是以是以线状还是环状线状还是环状存在的？存在的？命运如何？命运如何？ 内含子有无内含子有无调控调控作用？作用？ 核酶的发现及意义核酶的发现及意义1981年，年，T. Cech和和S. Altman 剪接识别顺序剪接识别顺序 Chambons rule GT-AG 内含子结构内含子结构 SnRNA在在RNA剪接中的作用。剪接中的作用。(small nuclear RNA)U-SnRNA 90-400nt 1978年，年，Sanger分析了分析了 174中的中的核苷酸，

5、核苷酸，5386个。个。 9个基因，编码个基因，编码2000个氨基酸。个氨基酸。 ? Barrell（Sanger实验室）实验室）噬菌体噬菌体 X174的重叠基因的重叠基因各基因的功能：各基因的功能：A，DNA单链合成和双链的复制；单链合成和双链的复制；B、C、D，单链的，单链的合成和（或）包装；合成和（或）包装；F、G、H，噬菌体衣壳的结构蛋白；，噬菌体衣壳的结构蛋白；J，参与病，参与病毒颗粒构成的一种小的碱性蛋白；毒颗粒构成的一种小的碱性蛋白；K，产物未知；，产物未知；E，细胞裂解，细胞裂解 包含包含 首尾重叠首尾重叠 三个基因的三重重叠三个基因的三重重叠 反向重叠反向重叠 操纵子重叠操纵

6、子重叠1950年，年，B. McClintock发现玉米中的发现玉米中的Ac-Ds系统。系统。 引起引起插入突变插入突变。 插入位置上出现插入位置上出现新基因新基因。 原来位置上原来位置上保持或切离保持或切离着原有的转座子。着原有的转座子。 造成插入位置上受体造成插入位置上受体DNA形成形成正向重复正向重复序列。序列。 调节基因活动调节基因活动的开关。的开关。 增加增加同源序列的整合同源序列的整合。不同门类生物的不同门类生物的C值分布值分布 结构基因，调控基因结构基因，调控基因 操纵子，操纵基因操纵子，操纵基因 断裂基因，断裂基因，Intron，Extron 重叠基因重叠基因 跳跃基因，转座子

7、跳跃基因，转座子 C值矛盾值矛盾组成组成Hemoglobin的四种多肽链在发育中是变化的。的四种多肽链在发育中是变化的。 将庞大的将庞大的DNA链切成小的可操作片断。链切成小的可操作片断。 对要保存和进一步研究的对要保存和进一步研究的DNA片断进片断进行扩增。行扩增。 证明、获取证明、获取DNA片断中所需基因。片断中所需基因。 对感兴趣的片断进行表征。对感兴趣的片断进行表征。常用限制性内切酶常用限制性内切酶种类及特性种类及特性W. Arber和和H. O. SmithDNA限制酶分析限制酶分析 连接酶连接酶T4 DNA Ligase 1967 修补工具酶修补工具酶DNA聚合酶聚合酶I 大片断大

8、片断 Klenow 1971 末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶 末端转移酶末端转移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾 反转录酶反转录酶PCR反应反应载体载体: A specialized DNA sequence that can enter a living cell, signal its presence to an investigator by conferring a detectable property on the host cell, and provide a means of replication for intself and foreign DNA inserted into it. 载体的条件载体的条件 ：a 复制起点复制起点 b 适宜的限制酶切点适宜的限制酶切点c 选择标记选择标记克隆载体克隆载体穿梭载体穿梭载体表达载体表达载体质粒质粒 噬菌体噬菌体 人工染色体人工染色体A collection of DNA clones that contains multiple copies of nearly every fragment in the whole genome inserted into a suitable vector and placed into storage. 遗传学方