非诺贝特对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究_徐平

1、作者单位 :1. 310024 浙 江 省 人 民 医 院 望 江 山 院 区 老 干部 科 ; 2. 311700 浙江省淳安县第一人民医院神经内科作者简介 :徐平 (1981- , 医师, , mail :w j 163. com ·基础研究 ·非诺贝特对大鼠心肌缺血再灌注损伤的 保护作用及其机制研究徐 平 1, 周 跃 1, 余 智 2摘 要 目的 探讨非诺贝特对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制 。 方法 将 64只 SD 大鼠随机分为 假手术组 、 缺血再灌注组 、 150mg /kg 非诺贝特组及 300mg /kg 非诺贝特组 , 每组各 16只 , 术

2、前 30min 分别给 予相应处 理 。 采取体内 结扎左前降支的方法建立心肌缺血再灌注损伤模型 , 予酶联免疫吸附法检测大鼠心肌组织中 NF -B p65及 IL -6水平 , H ·E 染色观察左心室前壁细胞病理形态学改变 , 并采用 Tunel 法检测心 肌细胞凋亡 率 。 结果 假手术组 大鼠心肌组织中 NF -B p65及 IL -6水 平 、 心肌细 胞凋 亡率分 别为 (8. 11±0. 83 pg /mg 、 (182. 67±0. 19 pg /mg 、 (5. 09±0. 79 %,与其余四组大鼠相比均显著降低 (P <0. 0

3、5 ; 与缺血再灌注组比较 , 非诺贝特组大鼠 心肌组织中 NF -B p65及 IL -6水平 , 心肌细胞凋亡率明显降低 (P <0. 05 , 且随着用药剂量的 增加而降低 , 两个不 同剂量组 比较 , 差异有 统计学 意义 (P <0. 05 。 缺血再灌注组与 300mg /kg 非诺贝特组中 NF -B p65及 IL -6含量水平差异有统计学意义 (r 1=0. 93, r 2 =0. 74, P <0. 01 。 结论 非诺贝特可通过负性调节 NF -B p65含量水平进而减 少 IL -6的释放 , 抑制心肌细胞的凋亡 , 从而在心肌缺血再灌注损伤中发挥保

4、护作用 。关键词 非诺贝特 ; 心肌缺血 /再灌注 ; 核转录因子 -B p65; 白介素 -6; 细胞凋亡中图分类号 :R54; R972 文献标识码 :A 文章编号 :1009-816X (2013 06-0449-04doi :10. 3969/j . issn . 1009-816X . 2013. 06. 08Study of Protection and Mechanisms of Fenofibrate in Rats with Myocardium Ischemia -reperfusion Injury . XU Ping , ZH O U Yue , YU Zhi . De

5、partment of Ger ontology , Zhejiang Pr ovincial Peo ple ' s Hos pital , Zhejiang 310024, ChinaAbstract Objective To explore the protection of fenofibrate in rats with myocardium ischemia -reperfus ion injury and its mecha -nis ms . Methods 64Sprague -Dawley rats were randomly divided into four g

6、roups as sham -operation group , ischemia -reperfusion group , 150mg /kg fenofibrate group and 300mg /kg -fenofibrate group , with 16rats in each group . Relevant treatments were given to rats 30min before myocardium ischemia operation respectively . A rat model of left anterior descendin g coronary

7、 artery was ligated for 45min and reperfused for 45min to establish the model of ischemia -reperfusion . Enzyme lin ked i mmunosorbent assay (ELISA was respectively used to detect levels of NF -B p65and IL -6in myocardium tissue ; H ·E stainin g is used to observe morp hologic changes of myocar

8、diu m cells in ischemia /reperfusion injury region . Tunel staining was used to detect cardiac myocyte apoptosis rate (C MAR . Results The levels of NF -B p65, IL -6and C MAR in s ham -operation group were (8. 11±0. 83 p g /mg , (182. 67±0. 19 pg /mg and 0. 79%respectivel y , which were si

9、gnificantly decreased compared with the other four groups (P <0. 05 . Com -pared with ischemia -reperfusion group , the levels of NF -B p65and IL -6, CMAR were significantly decreased in fenofibrate group (P <0. 05 ; and they were significantl y lower in 300mg /kg -fenofibrate group compared w

10、ith 150mg /kg -fenofibrate group (P <0. 05 . The levels of IL -6and NF -B p65in ischemia -reperfusion group and 300mg /k g -fenofibrate group were positivel y correlated (r 1=0. 93, r 2=0. 74, P <0. 01 . Conclusio ns Fenofibrate may reduce the release of IL -6through down -regulating NF -B p65

11、levels , and prevent myocardium cell apoptosis , and eventually provide protection from ischemia /reperfusion injury .Key words Fenofibrate ; Myocard ium ischemia /reperfusion ; Nuclear factor B p65; Interleukin -6; Cell apoptosis 心肌缺血再灌注损伤 (myocardial ischemia reper -fusion injury , MIRI 是指心肌缺血后恢复血

12、液供应时 心肌损伤较恢复前更为严重 , 继而引起细胞功能障碍 甚至或细胞死亡的现象 , 其发病机制方面的研究一直 备受广大学者的关注 。 近年研究表明 , 炎症反 应与 MIRI 的关系已成为近年相关研究领域的热点 1。 据 Matsushima 等 2报道 , 过氧化物酶体增殖物激活型受 体 -(Peroxisome pr oliferator -activated receptors -, PPAR - 激活后能从转录水平抑制炎症因子反应 , 从而明显 减轻心肌缺血引起的组织损伤 3, 但其具体机制尚未 -非 ·449· 心脑血管病防治 2013年 12月第 13卷 第

13、 6期 诺贝特 , 观察其对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎性反应 、 细胞病理形态学及细胞凋亡的影响 , 进一步探讨 非诺贝特心肌保护作用及其可能机制 。 1 材料与方法1. 1 材料 :健康雄性 SD 大鼠 64只 (浙江大学医学院 实验动物中心提供 , SPF 级 , 证书号 :2229601018 ; NF -B p65及 IL -6ELISA 试剂盒 (Sigma 公司 , 美国 ; 非诺 贝特 (R &D Systems 公 司 , 美国 ; 酶标 仪 (Heraeus 公 司 , 德国 , Labo fuge 400R 高速低温离心机 (BioTek 公 司 , 美国 , 原位

14、末端标记 (TUNEL 试剂盒 (Pr omega 公 司 , 美国 ; 电子显微镜 (OLYMPUS , 日本 等 。 1. 2 研究方法 :1. 2. 1 大鼠分组及处理 :将 64只 SD 大鼠 (体重 280330g , 按随机数表法分为 4组 (n =16 , 术前 12小 时禁食 , 但饮水自由 。(1 假手术组 :术前 30min 经腹 腔注射 300ml /kg 的 0. 9%氯化钠注射液 ; (2 缺血再 灌注组 :术前 30min 经腹腔注射 300ml /kg 的 0. 9%氯 化钠注射液 ; (3 150mg /kg 非诺贝特组 :术前 30min 经 腹腔注射 150

15、mg /kg 非诺贝特 ; (4 300mg /kg 非诺贝特 组 :术前 30min 经腹腔注射 300mg /kg 非诺贝特 。 1. 2. 2 建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 :按陈良 万法 4制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 。 经腹腔 注射 0. 3ml /kg 的 10%水合氯醛进行麻醉 , 气管切开 并插管 , 通气频率 65次 /分 , 呼吸比 1 1. 15, 心电图监 测 。 剖胸 , 带 6-0线的眼科针在大鼠左冠状动脉起始 部下方 1. 5mm 、 穿行在左心耳与左肺动脉窦之间 , 其 间置一塑料管 , 以止血钳夹紧 , 密切观察左心室前壁 心肌颜色改变及心电图变化 。

16、左心室前壁心肌组织 颜色变暗 , 同时心电图示 ST 段下降或抬高则判断为 左冠状动脉结扎成功 。 45min 后拔出塑料管 , 使左冠 状动脉 恢复血 流 45min , 再灌注 时局 部心 肌组织 充 血 。 假 手 术 组 大 鼠 只 在 左 冠 状 动 脉 起 始 部 下 方 1. 5mm 处穿线 , 但不结扎 , 其他步骤同模型组 。 1. 3 评价指标 :1. 3. 1 测定心肌组织中 NF -B p65及 IL -6的 水平 :各组大鼠再灌注结束后 , 随机抽取各组 8只大鼠 , 以4 肝素化 0. 9%氯化钠注射液进行 心脏快速灌洗 , 双肺变白后快速剪断心脏 , 取左心室前壁

17、心肌组织液 氮冷冻后将组织匀浆上清液作为检测标本 。 检测步 骤严格按 ELISA 试剂盒要求进行 。 1. 3. 2 心肌组织 H ·E 染色 :将各组其余 8只大鼠麻 醉 , 以 4 肝素化 0. 9%氯化钠注射液进行心脏灌洗 , 双肺变白后即换用 4 10%多聚甲醛快速灌 洗固定 至全身僵硬 , 并在左心室前壁留取心肌组织作为检测 标本制 成 蜡 块 。 从 心 尖至 心 底 部连 续 切 片 , 厚 约 3m 。 行常规 H ·E 染色后在光学显微镜下 (×400 观 察大鼠心肌细胞病理形态学变化并采图 。 1. 3. 3 心肌组织 Tunel 染色 :染

18、色步骤严格按 Tunel 试剂盒检测步骤进行 。 心 肌组织 Tunel 染色后 在光 学显微镜下 (×400 观察心肌细胞凋亡 (以胞质出现 棕黄染色颗粒代表 。 每张切片随机选取 10个高倍 视野 , 计数每个高倍镜视野内的阳性细胞核数 、 总的 有核细胞数 , 计算心肌细胞的凋亡率 (每个高倍镜视 野内的阳性细胞核数 /总的有核细胞数 ×100% , 取 平均值并采图 。 1. 4 统计学处理 :应用 SPSS 18. 0版软件进行统计学分析 。 计量资料用 (x -±s 表示 , 多组间比较 采用单 因素方差分析 (ANOVA , 两两比较采用 LSD -

19、t 检验 , 相关分析采用直线相关 , 以 P <0. 05为差异具有统 计学意义 。 2 结果2. 1 非诺贝特对心肌组织中 NF -B p65及 IL -6水平 的影响 :假手术组大鼠心肌组织中 NF -B p65及 IL -6水平均显著低于其余 3组 , 差异有统计学意义 (P <0. 05 ; 与缺血再灌注组大鼠相比 , 非诺贝特组预处理 组大鼠 NF -B p65及 IL -6水平均明显降低 (P <0. 05 且随着用 药剂量的增加而降低 , 两个不同剂量 组比较 , 差异有统计学意义 (P <0. 05 。 4组大鼠心肌组 织中 NF -B p65及 IL

20、 -6水平比较见表 1。表 1 4组 大鼠心肌组织中 NF -B p65及 IL -6含量水平及心肌细胞凋亡率的比较 (x -±s 组 别n NF -B p65(pg /mg IL -6(pg /mg 心 肌细胞凋亡率 (% 假手术组88. 11±0. 83182. 67±0. 195. 09±0. 79缺血再灌注组815. 52±0. 64 211. 23±0. 21 65. 21±8. 20 150mg /kg 非诺贝特组 812. 17±0. 49 201. 95±0. 67 57. 73±

21、;9. 35 300mg /kg 非诺贝特组 810. 58±0. 85*191. 07±0. 53 *48. 03±7. 62*F 值 139. 41151. 11103. 30P 值<0. 01<0. 01<0. 01 注 :与假手术组比较 P <0. 01; P <0. 05; 与 kg *<0. 05·450· Pre vention and Treatment of Cardio -Cerebral -Vascular Disease Dec 2013. Vol 13. No 62. 2 缺血再灌注

22、组及 300mg /kg 非诺贝特组大鼠心 肌组织中 NF -B p65与 IL -6水平的相关性分析 :缺血45min 再灌注 45min 后 , 缺血再灌注组与 300mg /kg 非 诺贝特组大鼠心肌组织中 NF -B p65与 IL -6水平均 呈显著正相关 , 以 NF -B p65含量水平为自变量 (in -dependent variable , 用 X 表 示 。 IL -6水 平 为因 变 量 (dependent variable , 用 Y 表示 。 求得回归方程为 Y -1=-0. 39+0. 22x , r 1=0. 93(P <0. 01 ; Y -2=-4.

23、 27+0. 39x , r 2=0. 74(P <0. 01 。 2. 3 非诺贝特对大鼠心肌组织病理形态学改变的影 响 :假手术组左心室缺血 再灌注区心肌 组织切片经H ·E 染色后可见心肌组织未见明显的出血 、 充血或炎性细胞的浸润 , 心肌纤维排列有序 , 肌节长度均匀 、 排 列整齐 , 横纹清楚 , 细胞轮廓及胞核较清晰 (图 A 。 缺 血再灌注组相应区域呈明显的缺血损伤性改变 , 间质 充血或出血 、 水肿明显且有炎症细胞浸润 , 大多数心肌 纤维变长 , 排列紊乱甚至断裂 , 肌纤维间距不同程度增 宽 , 而肌节缩短且排列不整齐 (图 B 。 150mg /k

24、g 非诺 贝特组相应区域缺血性损伤程度明显轻于模型组 , 心 肌纤维排列较整齐 , 肌节排列亦较为规整 , 少见红细胞 及炎性细胞浸润 (图 C , 而 300mg /kg 非诺贝特组的心 肌缺血损伤程度明显轻于 150mg /kg 非诺贝特组 。2. 4 非诺贝特对大鼠心肌细胞凋亡的影响 :假手术组大鼠心肌组织中少见凋亡 细胞 (图 A1 , 与其余 3组大鼠相比差 异均有统计学意义 (P <0. 01 。 缺血 再灌注组凋亡细胞阳性率为 (65. 21±8. 20 %,图 B1, 而 150mg /kg 非诺 贝特组相应区 域凋亡细胞阳 性率 (57. 73±9.

25、 35 %,图 C1, 两组相比差异均有统计学意义 (P <0. 01 ; 两个不同剂量组比较 , 300mg /kg 非诺贝特组相应区域凋亡细胞阳性率 (48. 03±7. 62% 显 著高于 150mg /kg 非诺贝特组 , 两组相比差异均有统 计学意义 (P <0. 05 图 D1。 4组大鼠心肌组 织中细 胞凋亡率的具体比较见表 1 。图 A1-C1 Tunel 染色结果 :棕褐色为凋亡细胞 , 蓝 色为正常细胞3 讨论心肌缺血性疾病对患者的生活质量及生命健康 造成严重影响 。 心肌缺血再灌注损伤 (MIRI 的机制十分复杂 , 主要与炎症反应 、 细胞凋亡及坏

26、死与心律 失常及心功能降低等密切相关 。 目前有研究报道 , 在 , 血缺氧及血液动力学的改变引起心肌细胞释放大量 炎症信号 , 促进炎性因子的聚集和释放5, 明显加剧了心肌的炎症反应 , 从而加速心肌细胞的凋亡 。 既往 研究表明 , 心肌缺血再灌注损伤过程中释放的白细胞 介素 -6(IL -6 可作为急性心肌缺血性疾病患者预后判 断的一个独立指标 6, 7。 本研究也发现缺血再 灌注 6·451· 心脑血管病防治 2013年 12月第 13卷 第 6期 升高 , 由此我们推测 IL -6在心肌缺 血再灌注损伤后 对细胞凋亡的发生具有十分重要的意义 。作为信号传导途径中的

27、重要因子之一 , 由多肽亚 单位 组 成 的 核 转 录 因 子 (nuclear transcription factor kappa B , NF -B 在参与炎症 、 肿瘤及免疫的发生和发 展 、 调节细胞凋亡等多种生理及病理过程中具有重要 作用 。 近期有研究报道 , NF -B 的表达上调与多种与 炎症反应过程发挥重要作用的细胞因子有关 8。 本 实验研究发现缺血再灌注组 NF -B p65的水平与假 手术组相比明显升高 , 且与 IL -6水 平变化成显著正 相关 , 这表明 NF -B p65在一定程度上是在心肌缺血 后被诱导释放进而促进 IL -6的表达 。PPAR -是 PP

28、ARs 的 3个亚型之一 , 其分布较为 广泛 , 主要分布在脂肪组织 , 但在心肌组织也有一定 量的表达 9。 研 究发现 , PPAR -具 有抑制心肌组织 炎性 细 胞因 子 的 表 达 及 心 肌 细 胞 肥 大 等 重 要 作 用 10, 11。 非诺贝特 (fenofibrate , FF 是 PPAR -选择性 激动剂 , 主要用于调节血脂 。 近来越来越多的研究表 明非诺贝特可明显减轻心肌缺血引起的组织损伤 3, 但其具体机制尚未阐释清楚 。 本实验中经非诺贝特 预处理后的大鼠左心室前壁组织中 NF -B p65和 IL -6的水平显著降低 、 二者水平变化呈明显的正相关性 ,

29、 并且心肌细胞凋亡数量明显减少 , 由此我们认为非诺 贝特具有降低诱发 NF -kB p65的释放能力 , 进而降低 IL -6的含量水平 , 达到减少心肌细胞凋亡的作用 ; 且 两 个 不 同 剂 量 组 比 较 , 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0. 05 。 提示非诺贝特对心肌再灌注损伤的保护作用 随着用药剂量的增加而增强 。同时 , 病理学观察结果中 , 缺血再灌注组大鼠在 心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞发生了明显的细 胞空泡变性坏死 , 符合心肌细胞缺血缺氧性病理学变 化 ; 而经非诺贝特预处理组的大鼠则以心肌细胞肿胀 为主 , 且 300mg /kg 非诺贝特组的

30、心肌损伤程度明显 轻于 150mg /kg 非诺贝特组 (P <0. 05 。 这也表明非 诺贝特具有延缓或阻止心肌细胞坏死的作用 , 对减少 心肌缺血再灌注损伤具有积极意义 , 其保护作用与剂 量有一定的相关性 。综上所述 , 非诺贝特通过激活 PPAR -后下调心 肌缺血再灌注损伤组织中 NF -B p65的释放 , 进一步 降低促炎介质 (IL -6 的含量水平 , 有效缓解了大鼠缺 血再灌注后的损伤 , 从而减少心肌细胞凋亡 , 为其在 缺血性心血管疾病的临床使用中提供参考依据 。 参考文献1Nakka V P , Gus ain A , Mehta S L , et al .

31、Molecular mechanis ms of apop -tos is in cerebral ische mia :multiple neuroprotective opportunities J . Mol Neurobiol , 2008, 37(1 :37-38.2M ats ushima S , Kuroda J , Ago T , et al . Broad s uppres sion of NAD PH oxi -dase activit y exacerbates ischemia /reperfus ion injury through inadvertent downr

32、egulation of hypoxia -inducible factor -1and upregulation of peroxi -s ome proliferator -activated receptor -J . Circ Res , 2013, 112(8 :1135-1149.3Ravingerova T , Carnic ka S , Ne mcekova M , et al . PP AR -alpha activation as a preconditioning -l ike intervention in rats in vivo confers myocardial pro -tection agains t acute isc haemia -reperfusion injury :involvement of PI3K -Akt J . Can J Phys iol Pharmacol , 2012, 90(8 :1135-1144.4陈良万 , 郭加强 . 缺血再灌注损伤对心肌表达外源性基因 能力的影 响 J . 中国病理生理杂志 , 2001, 17(12 :1254-1255.5A . Denes ,