人骨髓间充质干细胞的扩增及向成软骨样细胞的诱导分化_图文

1、人骨髓间充质干细胞的扩增及向成软骨样细胞的诱导分化邱丽燕,王金福(浙江大学生命科学学院 浙江杭州 310012摘要 从人骨髓中分离和培养间充质干细胞,在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致。流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR 阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养的MSCs 代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞纯度增加。第三代的MSCs 大约有80%处于G 0/G 1期,S+G 2+M 期约20%左右,说明MSCs 有强大的增殖潜能。MSCs 在传代培养中的最适接种密度约为5.0×10

2、3/cm 2 左右。MSCs 在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期三个时期,传代培养的MSCs 生长速度比原代的MSCs 明显快很多。采用程序降温法对MSCs 进行冻存,6090天后对冻存的MSCs 进行复苏,发现MSCs 仍可在体外良好生长46代,特定的MSCs 样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力。对四例标本的前三代MSCs 在体外利用TGF 1和维生素C 诱导两周后,用RT-PCR 证明MSCs 表达软骨特异性的II 型前胶原的mRNA ,说明我们培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs 。关键词 骨髓间充质干细胞 扩增 成软骨样细胞Ex

3、pansion and Chondrogenic Induction of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Qiu Liyan, Wang Jinfu(College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310012Abstract MSCs from human BM were isolated by Ficoll density centrifugation and cultured expanded in DMEM-LG containing FBS. MSCs

4、 are adherent and fibroblastic, and maintained similar morphology with passaging. Flow cytometry analysis indicated that MSCs were universally positive for CD29, CD166, and negative for CD34, CD45, CD117, and HLA-DR. At passage 3, cell cycle status analysis by measuring DNA content revealed that a s

5、mall population of the cells was engaged in proliferation (S+G 2+M=20%, and more than 80% of cells were in G 0/G 1 phase. The number of cells in G 0/G 1 phase decreased with passage. In passage culture, It is proper for the cells plated at the density of 5000 cells/cm 2 to propagate. The MSCs of pas

6、sage 1 to 3 were froze in liquid nitrogen by two-step frozen procedure ,after 6090 days, we thawed the frozen MSCs and found the cells can proliferate about 46 passages in vitro ,10 passages especially for sample 17. It suggested that the frozen MSCs still have good expansion ability. At passage 1 t

7、o 3, four cases was induced by the combination of TGF-1 and Vitamine C in vitro for two weeks and expressed articular cartilage matrix-procollagen II mRNA.Key word Mesenchymal stem cells (MSCs, expansion, chondrocyte骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs是存在于骨髓中的一类多能干细胞。Friedenstein 等1首先发现MSCs 在体外可分化为

8、骨和软骨组织,即使经过20-30次细胞分裂后,其分化特性也不会消失。Pittenger 等2通过扩增单个MSCs 的克隆后,在不同的条件下诱导其分化,结果分别分化出骨,软骨,脂肪组织。随后,Piersma 等人发现MSCs 在体外除了可以诱导分化为骨、软骨、脂肪外,甚至还可以分化为肌肉组织3, 4。最近又有学者证实MSCs 可以向神经细胞、造血细胞等多种终末分化细胞分化5-7。Friedenstein 等1建立了MSCs 分离及扩增的方法,并多次对该方法进行了改进。但是,人们对这种细胞本身的认识还远远不足。至今还未能筛选到MSCs 特异性的标记分子,尚未能建立鉴定MSCs 的统一标准,不同实验

9、室的数据之间的可比性较差。所以,寻求MSCs 的稳定培养条件还有待进一步的研究。本文通过分离和体外培养扩增MSCs ,观察MSCs 的形态,测定细胞生长动态,寻求_MSCs合适的接种密度,利用流式细胞仪对培养的细胞进行表面标记的测定和细胞周期的分析,并且通过体外诱导MSCs向软骨方向分化,检测软骨特有的II型前胶原mRNA的表达,从而研究MSCs的生物学性状,为将来MSCs在组织工程,细胞工程,基因治疗以及临床应用打下基础。1 材料和方法1.1 MSCs的分离和培养:取成人骨髓3-5ml,用等量的PBS洗涤后900×g离心。沉淀用含10% FBS的DMEM-LG 培养液重新混匀后,用

10、Ficoll分离液分离和收集单个核细胞层。调节细胞密度至5×106/ml,接种于底面积为25cm2的培养瓶中,放置于37,5%CO2培养箱内培养,48h后更换培养液。当原代培养的细胞生长到培养瓶底的大约90%时,用消化液消化和悬浮细胞。经离心洗涤后,重新悬浮细胞。按1:3进行传代培养。1.2流式细胞仪分析培养的细胞生长到大约80-90%融合后,用消化液消化成单细胞悬液,400×g离心后收集细胞。分别加入荧光标记的抗体,4孵育30min,然后PBS洗去未标记抗体,10g/L多聚甲醛固定。用流式细胞仪检测细胞CD34、CD29、CD45、CD166、CD117、HLA-DR表面

11、抗原。每个样本至少分析1×105个细胞。1.3细胞周期的测定将贴壁细胞消化,70%冷乙醇4固定24h,PBS液洗涤细胞二遍, 10mg/mlPI染液染色(4避光30min,用流式细胞仪FACScan检测,Multicycle软件分析结果。1.4接种密度取生长旺盛时期的细胞,以如下密度:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0×103/cm2接种于12孔板中。培养10天后用消化液消化,并记数细胞量。以接种密度为横坐标,细胞扩增的倍数为纵坐标作图,寻找最合适的细胞接种密度.1.5生长曲线的测定取生长良好的MSCs的P2,P4,P6代细胞,

12、以1×104个/孔接种于24孔板中,加入含10%FBS的DMEM-LG培养液,每24h计数3孔细胞。以细胞数为纵坐标,天数为横坐标绘制细胞生长曲线。1.6 MSCs的冻存将生长情况良好的P1、P2、P3代的MSCs用消化液消化成单细胞悬液,400×g离心后收集细胞沉淀。用冻存液重悬细胞,使细胞密度达到1×106个/ml。于4冰箱中平衡后,放入预冷4的程序降温仪中,用两步降温法:第一阶段:4-40,降温速率1/min;第二阶段:-40-80,降温速率为5/min。然后-196液氮罐内保存。复温时从液氮中取出样品立即放入40水浴锅内摇动冻存管,1-2min复温完毕,

13、400×g离心后收集细胞,加入新鲜培养液放入CO2培养箱中培养。1.7 成软骨细胞的诱导选前三代生长良好的MSCs,消化后制成单细胞悬液,以3×104/ml的密度接种于细胞瓶中。待细胞达到80-90%融合后,实验组3瓶加入成软骨细胞的诱导液(DEME高糖培养液,10%胎牛血清,100u/ml青霉素,100g/ml链霉素,TGF110ng/ml,抗坏血酸50µg/ml,对照组继续用常规培养液,每隔三天换液一次。14天后终止诱导。提取总RNA,设计II型前胶元的引物序列,COL(II上游:5-TTCAGC TATGGAGATGACAATC-3,下游:5-AGAGTCC

14、TAGAGTGACTGAG-3,产物片断475bp,进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察,检测II型前胶元mRNA的表达。2 结果2.1 MSCs的培养扩增及形态特征从骨髓中分离单个核细胞接种培养后,24h即可观察到部分细胞贴壁,贴壁的细胞大部分为圆形,椭圆形,有少数伸出突起的细胞;48-72h可观察到贴壁的细胞大部分呈纤维状,也有少量的为宽阔、平坦的三角状、星状等;接种后5-7天,可见明显的集落形成(图1A。集落中的细胞不断扩增,呈放射状向周围扩展,逐渐与邻近集落相融合。大约14-17天的时间,原代培养的细胞相互汇合可达到90%的生长表面。传代培养的细胞24h之内,绝大部分细胞

15、贴壁且成纤维状,更换培养液将未贴壁的造血细胞排除,约4-7天传代培养的细胞达到90%的融合(图1B。经传代培养后,细胞的形态更加趋于一致。 A B图1 原代MSCs形成的集落(A和传代培养形成贴壁细胞层的MSCs(B(10×10倍 Figure 1. MSC colonies in the first generation culture (A and the confluent MSC layer inthe passaging culture (B (10×102.2 细胞周期结果用流式细胞仪测定人MSCs内DNA的含量,第3代细胞处于分裂期(S+G2+M的约19.5%

16、左右,处于G0/G1期的细胞的约81.5%左右(如图2。 图2:人MSCs细胞周期检测Figure 2. The cell cycle of MSCs during the Log phase of growth.On the average, 81.5% of cells were at G0/G1, 12.6% at S, and 5.9% at G2/M phase of cell cycle2.3 MSCs表面标记物的流式细胞仪分析结果经流式细胞仪检测分析,培养的MSCs CD45、CD34、CD117和HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性(图3。对同一标本的第二代至第四代进行M

17、SCs表面标记物的检测,发现不但同一代细胞不同标记物阳性或阴性的比例不同,不同代次的细胞同一标记物的比例也不同。随代次的增加,其中CD166的阳性比例由68.9%上升到93.5%,CD29的阳性比例由48.8%上升到87.4%。 HLA-DR CD29 CD45 CD34 CD117 CD166图3 流式细胞仪检测MSCs表面标记物Figure 3. Flow cytometry analysis of MSCs It indicates that MSCs were universally positive for CD29, CD166,and negative for CD34, CD4

18、5, CD117, and HLA-DR.2.4 细胞生长曲线MSCs的生长曲线呈S型,符合Loigistic生长曲线。骨髓MSCs传代培养的细胞较原代的细胞生长要快,一般在接种后的第47天即可铺满培养底面;多数样本在第710代出现衰老现象。可以发现传代培养具有以下特征(如图4:(1每次传代培养的生长滞缓期24 36h;(2每次传代培养的骨髓MSCs对数增殖期为24天;(3对数增殖期结束后,进入平台期。图4是标本15的P2、P4、P6代传代培养的生长曲线,随着代次的增加,MSCs 的增殖能力开始减弱。 图4 人骨髓MSCs 的P2、P4、P6代传代培养生长曲线Figure 4. Growth

19、dynamics of MSCs in P2, P4 and P6 passages2.5 最适接种密度将生长旺盛的细胞以不同密度接种于12孔板中,倒置显微镜下进行观察。以13×103/cm 2的密度接种后,细胞稀疏,间距大,增殖缓慢,随培养时间的延长,细胞变得扁平,细胞内出现空泡等老化特征。以密度为5.0×103/cm2接种时,细胞活性好,生长旺盛,形态为有规则的束状。密度在7×103/cm 2 及其以上时,细胞生长拥挤,多见有非贴壁细胞,随时间的推移,细胞老化快。从图5可以看到,在继代培养中间充质干细胞的最适接种密度在5.0×103/cm 2左右。密

20、度高于或低于5.0×103/cm 2,细胞扩增倍数都要减少。 图5 接种密度对MSCs 生长的影响 图6 冻存复苏后培养扩增的细胞量Figure 5. Effect of plant density on growth of MSCs Figure 6. Expansion of frozen MSCs2.6 冻存后细胞的复苏6090天后,将冻存的MSCs 复苏。我们共复苏了8份标本,发现24h 内大部分细胞贴壁,培养液中有少量碎片悬浮,复苏后首次培养细胞达到90%的融合大约需79d 。其中7份标本的细胞在体外继续生长46代左右才开始出现老化特征,另一标本17于P1代开始冻存,大约6

21、0天后进行复苏,复苏后在体外又继续生长了10代,细胞增殖一直旺盛,10代以后才开始出现了老化特征(图6。2.7 向软骨细胞方向的诱导:诱导前三天未见细胞形态有明显的变化,从第4-5天起光镜下观察细胞慢慢收缩,细胞_ 中国科技论文在线 变小， 细胞间隙逐渐变大， 细胞变为不规则的形状。 从诱导后的细胞提取的总 RNA 经 RT-PCR 扩增后， 可见在 400bp500bp 条带间有明显的荧光印记， 而对照组未发现有表达 （如图 8） 。 该实验共重复 4 个标本，选前三代的细胞诱导，均为相同的结果。 图 7 诱导后 MSCs 表达前 II 型胶原 mRNA 的电泳图（RT-PCR 检测） A:

22、 marker; B,C,D:诱导组; E:对照组. Fig.8 Expression of procollagen II mRNA in MSCs after induced by TGF-1 (RT-PCR A: marker; B,C,D: the induced cells; E: The controled cells. 讨论 1968 年，Friedenstein 等1利用自然贴壁法获得的骨髓基质细胞中首先证明了 MSCs 的 存在。 但到目前为止仍没有十分完善的获得和培养扩增 MSCs 的方案， 大多数实验室都是根 1 据 Friedenstein 等 报道的 MSCs 的贴壁性

23、来分离的。相对于骨髓中其他种类的细胞而言， MSC 在骨髓中的丰度并不高，1×1051×106 个骨髓单个核细胞中约含有 1 个 MSCs8。因 此要获得足量的 MSCs，将体内的骨髓 MSC 在离体条件下进行分离纯化并实行体外扩增就 显得尤为重要。我们的实验设计首先利用密度为 1.077g/ml 的 Ficoll 分离液来分离单个核细 胞，分离到的细胞接种于 DMEM-LG 培养液中，再利用 MSCs 黏附于培养板的特点，通过 更换培养液以去除悬浮生长的红细胞和白细胞，从而获得较纯的 MSCs。在原代培养中发现 除了有成纤维状的细胞外， 还有许多圆型的细胞贴在培养瓶壁上或

24、者成纤维细胞的上面， 随 着更换培养液而逐渐去除， 推测这些细胞主要为造血细胞， 所余的贴壁细胞即主要为 MSCs。 将冻存的 MSCs 复苏后，发现复苏后首次培养细胞潜伏期略长，但到细胞融合传代后， 细胞的生长情况和常规传代培养的间充质干细胞增殖情况差异不大，47 天达到 90%的融 合。至今为止，国外内尚未有关于将人 MSCs 冷冻保存并复苏后生长动态的报道。我们的实 验根据“慢冻速融”的原理，利用两步降温法对 MSCs 进行降温，同时参考国外学者的研究 加大了冻存液中血清的含量， 二至三个月后复苏了 8 份标本。 复苏后 MSCs 增殖的情况表明， 复苏后的 MSCs 仍具有良好的增殖能

25、力。 MSCs 表面标志并非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，一般 认为整合素家族成员 CD29、粘附分子 CD44、CD166 以及 CD105 等是 MSCs 的重要标志 物，MSCs 属非造血类细胞，造血细胞表面抗原如造血前体细胞标志抗原 CD34、成熟造血 细胞标志抗原 CD38、白细胞标志抗原 CD45、淋巴细胞表面抗原 CD11a 和单核细胞/ 巨噬 细胞表面抗原 CD14 阴性，HLA-DR（HLA II 类分子）也为阴性 9-11。本实验选择了 CD34， CD45， CD166， CD117， CD29 和 HLA-DR 六种抗体， 并对 7 份生长良好的

26、标本进行了检测， 所得结果与上述报道相似。不同代次的 MSCs 表面标记物检测表明，CD166、CD29 的阳性 比例随着代次的增加而上升，而 CD45、CD34、CD117、HLA-DR 的阳性比例则逐渐降低， 说明随着传代培养，MSCs 逐渐达到纯化。 MSCs 的体外扩增与种植密度关系很大。Bruder8等报道，人 MSCs 传代时以 5000 个 _ 中国科技论文在线 细胞/cm2 相对较低的密度接种时后，大约两周后能扩增 3-5 倍长成单层。David 等12报道， 如果以 1.53 个细胞/cm2 的极低密度培养， 更加有利于 MSCs 的增殖。 更低的密度接种后， 细胞在两周内能

27、平均扩增 600 倍。Elisabeth 等13发现小鼠 MSCs 对低密度接种的反应更加 敏感，以 2 个细胞/cm2 的密度接种以后细胞在 12 天内平均扩增了 400 倍，其最大扩增倍数 大约是人 MSCs 的两倍， 而且低密度接种 4 周以后小鼠 MSCs 形成的克隆几乎可以汇合成单 层，但人的在 2-3 周以后即停止了生长，不能形成单层。我们在实验中发现，高密度接种时， 若接种密度过高，容易出现接触抑制，使 MSCs 缺乏应有的生存空间，非贴壁和死亡细胞增 多而密度相对较低，细胞间隙过大，细胞缺乏应有的相互接触而不能正常生长，本实验结 果说明 5000 个细胞/cm2 左右是最合适的

28、接种密度，这与 Bruder 的报道一致，在继代培养时 可按照该接种密度进行传代。 我们以极低密度接种后培养， 观察到细胞分裂二至三次就出现 12 老化现象，未能发现达到 David 的实验结果。推测原因可能是分离到的 MSCs 纯度不够， 加上接种密度低，接种的细胞可能是增殖能力相对较差的 MSCs 分化的后代。 干细胞在增殖过程中处于相对静止状态，由短暂扩充细胞完成 DNA 合成和细胞扩充的 任务，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞阶段12。基于这一特性，本文对 MSCs 进行细胞 周期检测，结果表明大部分细胞处于 G0/G1 期，说明在我们的培养条件下大部分细胞处于相 对不活跃的静止期，只有

29、少数的细胞处于活跃的增殖状态。 人 MSCs 的体外培养经历了生长滞缓期， 对数生长期和生长平稳期三个时期。 我们选择 了第二、四、六代的细胞进行了生长曲线的分析，发现这早中晚三代的细胞其传代培养的细 胞的生长曲线都有以下共同的特征： 细胞传代后第一天细胞数没有明显变化， 有的甚至还有 所减少，传代培养潜伏期约为 2436 h，第 23 天后细胞开始增多，细胞进入对数生长期， 46 天以后到第 89 天 MSC 生长逐渐缓慢，进入平台期。以后细胞开始慢慢减少。这说 明当 MSCs 进入一个新的培养系统中，首先需要细胞贴壁适应，然后才开始增殖生长，而当 细胞密度增大和细胞间发生接触后， 就会限制

30、细胞的进一步增殖。 还发现早期的细胞增殖能 力要强于中晚期的细胞。 许多研究证实骨髓来源的 MSCs 植入体内后，能向软骨分化。然而在体外单层培养的 MSCs 向软骨表型分化还未得到充分证明。有学者尝试利用地塞米松对 MSCs 进行诱导，但 地塞米松可以诱导 MSCs 表达碱性磷酸酶， 具有诱导成骨的特性， 并且还可以抑制细胞增殖 15 。我们选择了 TGF-1 在 DMEM-HG 培养基中进行诱导。本实验培养的 MSCs 在体外诱 导两周后，RT-PCR 反应证实该诱导条件下 MSCs 表达软骨特异性的 II 型前胶原的 mRNA， 这与尹占海等的报道结果相似16。本实验说明，人 MSCs

31、具有向成软骨样细胞分化的潜能， 诱导后的细胞表达软骨细胞特有的 II 型前胶原的 mRNA。 参 考 文 献 1 Friendenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic transplants of bone marrow, Analysis of precursor cells, for osteogenic and hematotoxic tissues. Transplantation J, 1968, 6: 230-247. 2 Pittenger F, Mackay A, Beck S et al. Mult

32、ilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science J,1999, 284: 143147 3 Piersma AH, Brockbank KG, Ploemacher RE, et al. Characterization of fibroblastic stromal cells from murine bone marrow. Hematol J, 1985, 13: 237-43. 4 Wakitani S, Saito T, Caplan AJ. Myogenic cells derived from r

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