细胞培养试剂

1、细胞培养试剂、冷冻和复苏细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基：干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程 繁琐，质量不易控制：液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用 十分方便常用的培养基种类：RPMI-1640 （标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、 M199、 F10 等1000 ml RPMI 1640 培养基RPMI 1610 干粉培养基10. 4g （1包）蒸愉水400ml磁力搅拌至完全溶解I加三蒸懈水泄容至1000ml在超净台内无菌条件下，用火菌后的并置有0. 22 Pm孔径滤膜的

2、过滤器除菌,并分装成200 ml/瓶，-20C保存备用。用前取一瓶溶解，每200 ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%,即加22ml0再加青每素和链福素至终浓度各为100 U/mloI细胞培养液血清热灭活：569, 30分钟加热已完全解冻的血淸热火活目的：火活血淸中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血淸不要 灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细 胞生长速度，且细胞贴壁率降低.血清中的沉淀物：絮状物：I血淸中的脂蛋白变性及解冻后血淸中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血淸 本身的质量。可用离心3000 rpm, 5分钟去除，也可不用处

3、理-显微镜下小黑点”：经过热处理过的血淸，沉淀物的形成会显著增务。有些沉淀物在 显微镜下观察象小黑点”，常误认为血淸受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血淸质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血淸 平衡盐液体组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生 存所需的能量和无机离子成分，用于洗涤组织、细胞等PBS (Phosphate-Buffered Sallines):KC10. 20gKH：PO；0. 20gNaCl8. 00gNa：HP07H：02. 16gDPBS (Dulbecco, sPhosphate-Buffered Sallines

4、)标准型CaCl=(无水氯化钙)0. lOgKC10. 20gKH：P0t0.20gMg：3 6H200. lOgNaCl8. OOgNa：HP0i 7H：02. 16gD-Hanks，平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)KC10. 40gKHM0. 06gNaCl8. OOgNaC030. 35gNa2HP010. 048gD-Glucosel.OOgPheno1 RedO.Olg消化液：分离组织和分散细胞-常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用胰蛋白酶溶液-主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散一

5、消化细胞时，加入一些血淸或含血淸的培养液，能终止消化作用一胰蛋白酶溶液配制1、称取胰蛋白酶粉末苣烧杯中，用少许D-Hanks平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，宜室温4小时或冰箱过夜，不断搅 拌振荡2、次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，-20C保存备用(以免分解失效),常用浓度为0.25% (0. 1%-0. 5%)3、胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可用碳酸氢钠溶液调pH至7. 2 左右EDTA 4Na 溶液一种化学螯合剂，对细胞有一左的离散作用，毒性小，价格低廉,使用方便常用工作液浓度为0. 02%c注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留

6、的EDTA会影响细胞生长一EDTA溶液配制：用D-Hanks平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽火菌,分装成小瓶，4C冰箱保存调整液NaHC03溶液常用浓度为7. 5%o配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或髙压灭菌，分装.4C保存HEPES （分子fi 238. 31）溶液1、一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒 性2、主要作用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件 F，观察细胞时培养基脱离了 5%C02的环境,C02气体迅速逸出，pH迅速升髙,若加了 HEPES, 此时可以维持pH7. 0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES3、使用终浓度一般为10-50mmol/L4、常配成1M

7、储存液：用20ml双蒸水溶解4. 76克HEPES, 过滤除菌或髙压火菌，分装小瓶，4C保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓 缩液，终浓度为20逊。1几谷氨酰胺补充液- 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加， 由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4C下放苣7天即可分解约50%,所以都是在使 用前添加一配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4C放置2周以上时，要重新加入原来坛的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内，使用终浓度为1-4 mmol/Lo- 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200 minol/L （29. 22 g/L）- 配制方法

8、为：谷奴酰胺2. 922 g溶于三蒸水加至100ml即配成200 nmiol/L 的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30C）,过滤除菌，分装小瓶，-20C保存，使用时可向 100 ml培养液中加入0. 5-2 ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4 mmol/L酚红一大多数培养液中使用酚红作为pH指示：红色表示中性pH,黄色代表酸性pH,紫色表示碱性pH；一在一些特殊培养液中不含酚红：因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌 激素）样作用抗生素溶液-抗生素使用种类与浓度：抗生素工作浓度储存温度杀火细菌penicillin(青儘素)100u/ml-20CG(+)streptomycin (链

9、莓素)100ug/ml-20 CG(+)、G (-)gentamicin （庆大鑫素）50ug/ml-20CG（+）、G（-）、支原体ug/mlug/ml-20C-204C真菌nystatin （制霉菌素）貞菌哺乳动物细胞冷冻保存-冷冻保存要点：1、冷冻过程要缓慢4 C 30-60 分钟I-204C 30 分钟I-80*C 16-18小时（或过夜）I液氮长期保存2、冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90%,无微生 物污染。3、细胞浓度控制在：lX107-5X107/ml.一常用细胞冷冻保存液10%DMS0 +完全细胞生长培养液（20% 1血淸+基础培养液）10%甘油+完全细胞生长培养液（20%血清+基础培养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点- 快速解冻1 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37C水浴中，轻 轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）：2 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMS0：3 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应 先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶