抗高血压肽IYPR的原核表达、纯化与活性分析

1、抗高血压肽IYPR的原核表达、纯化与活性分析抗高血压肽是一种血管紧张素转化酶(AngiotensinI-ConvertingEnzyme,ACE抑制剂，通过抑制ACE的活性,调节肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统来起到降血压的作用。它具有安全性高、效果专一无副作用、易被人体消化吸收、稳定性好等特点,广泛受到患者的青睐。目前为止,抗高血压肽的生产基本都是通过酶解法生产制备得到,但是酶解法分离纯化工艺复杂、产量低。为了找到简单经济的制备抗高血压肽(简称降血压肽)的方法,给新型降血压产品的生产研究提供理论基础和科学依据,本课题的研究目的是构建表达降血压肽IYPR(Ile-Tyr-Pro-Ar

2、g)的基因工程菌,并对该菌进行诱导表达、分离纯化表达产物、分析产物的生物活性和稳定性等,并研究超声法对工程菌的生长和重组蛋白表达的影响,主要研究内容及结果如下:1.根据IYPR的氨基酸序列和大肠埃希杆菌(Escherichiacoli,E.coli,又称大肠杆菌)BL21(DE3)偏爱的密码子，人工设计并合成了目的基因序列，该基因序列与载体通过酶切、目的序列回收和连接等步骤,构建了表达载体pET-30a(+)-IR,然后将该载体转化到大肠杆菌中,从转化的平板中筛选出阳性重组子,该重组子经过菌落PC蝶定和基因测序，结果显示构建的基因工程菌中的目的基因符合设计要求,无移码和错码。2 .将构建的基因

3、工程菌利用异内基-B-D-硫代半乳糖甘(IPTG)进行诱导表达，并研究不同IPTG浓度、不同诱导时间、培养基组成和外源添加物对表达效果的影响,利用Tricine-SDS-PAGE电泳对表达情况进行检测分析。结果显示,与未进行诱导的菌株相比，经过IPTG诱导的工程菌在分子量大小约8.0kDa左右有明显的蛋白表达,且这一蛋白分子量大小与设计的分子量大小吻合。在选用的五种培养细菌的常用培养基LB、TB SOC SOBR 2XYT中，通过诱发培养发现,LB液体培养基是最好的,在LB中添加5mmol/LEDTA1%8萄糖、5mmol/LCa2+和5mmol/LMg2+等对重组蛋白的表达没有起到任何促进作

4、用。最佳的IPTG浓度为0.6mmol/L,37C诱导培养时间为9h,此时重组蛋白的表达量占总蛋白量的29%。3 .研究了降血压肽IYPR的分离纯化过程,发酵得到的培养液经过离心、超声破碎和洗涤后得到包涵体蛋白,该蛋白经过镍柱亲和层析、肠激酶酶切、透析法去标签、胰蛋白酶酶切和SephadexG-15凝胶过滤纯化后，得到的产物经电喷雾电离质谱分析证实了分离得到的产物分子量为548.23Da,氨基酸序列为Ile-Tyr-Pro-Arg。4.生产加工过程中的温度、pH变化及体内外消化酶酶解环境是否影响重组降血压肽IYPR的活性,对于了解其应用性十分重要。采用FAPG血管紧张素I模拟物的分光光度法测定

5、了IYPR的体外ACEW制活性,并对其热稳定性、耐酸碱性、抗肠道酶解能力和抑制动力学特征进行了研究。结果得到，重组IYPR的IC50值为61mg/L,具有较好的热稳定性，当90c处理1h时,其抑制活性为原来的98%,且在酸性、中性和弱碱性（pH2至10）条件下都很稳定，经过胃蛋白酶消化后，IYPR的ACEM制活性升高了13.0%,而经过胰蛋白酶消化后,其活性基本没有变化。Lineweaver-Burk双倒数作图法得到IYPR的抑制动力学模式为竞争性抑制。5.采用不同剂量的重组降血压肽对原发性高血压大鼠（SHR）进行一次性灌胃和连续35天灌胃试验,测定大鼠尾部的收缩压（SBP）,并分析灌胃结束后

6、血清中胆固醇、甘油三酯和葡萄糖的含量及全血的相关血液学指标。结果显示，利用400叱g/kg和1000叱g/kg的重组降血压肽对SHFfi行一次性灌胃后,大鼠的尾部收缩压明显降低(P<0.05),且降压活性维持时间大于8h,当灌胃剂量为400g/kg时，灌胃后4h血压降幅最大为50mmHg(P<0.01)。用400g/kg的重组降血压肽分别对SH欢鼠和正常SD大鼠进行连续35天灌胃,SHR大鼠的血压一直较对照组低(P<0.05),而正常大鼠的血压没有明显变化。在灌胃后的第3周，重组降血压肽使SHRfc鼠血压降低了44mmHg,效果优于高于该剂量500倍剂

7、量为200mg/kg条斑紫菜降血压肽、与高于该剂量75倍剂量为30mg/kg的卡托普利效果比较接近,但重组降血压肽降血压效果的稳定性显著优于卡托普利。灌胃结束后重组降血压肽组的SH戏鼠和SD大鼠血清中胆固醇、甘油三酯和葡萄糖的含量及全血的相关血液学指标,较对照组均没有显著性变化(P>0.05)。将心、肝、肾组织进行石蜡切片、苏木精-伊红(HE)染色后显微镜观察,结果显示,对照组和试验组的大鼠的相关组织结构没有明显差异。6.不同生长阶段的工程菌被低强度超声波处理一定时间后,采用分光光度法测定其生长速度、Tricine-SDS-PAGE法检测重组蛋白的表达情况。结果显示,扫频超声对工程菌生长的促进效果优于定频,利用扫频频率为28±2kHz的超声波在时期1对工程菌处理30min后能明显促进其生长,而此时超声处理5、30和60min对重组蛋白的表达均没有明显影响。在生长密度达到OD600=1.0(时期2)时超声对菌株生长和蛋白表达都具有抑制作用，而在工程菌受到IPTG的诱导2h后(时期3)超声处理不同时间，工程菌的生长和蛋白的表达量没有明显变化。利用Fura-2/AM荧光法测定细菌细胞的钙离子浓度,结果显示