在小鼠矽肺模型中调节性T细胞促进Th细胞的分化

1、Tregs促进小鼠矽肺模型中Th17细胞的分化幸文定（江西农业大学动物科学技术学院 学号：0202013206）摘要背景：硅肺是一种由吸入硅尘引起并以肺部炎症和纤维化为特征的职业性肺病。以前的研究表明，在肺部Tregs通过调节免疫稳态来调控硅肺的发病进程。Th17细胞与Tregs互享发育途径，Th17通过招募和启动中性粒细胞，在许多肺部疾病的免疫发病机制中发挥关键作用，但Tregs对SiO2致肺纤维化中Th17细胞反应的调节功能还有待探索。方法/主要结果：为了评估Th17细胞和IL-17在硅肺的发展中的作用及其与Tregs的相互作用，Tregs消除的小鼠模型产生和暴露于SiO2以此建立矽肺实验

2、模型。在此我们发现，在肺纤维化中SiO2增加Th17细胞反应。Tregs消除增强中性粒细胞的积累和在SiO2致肺纤维化中减弱Th17细胞的反应。从mRNA和蛋白的结果表明，Tregs通过调节TGF-1和IL-1来发挥其对Th17细胞和IL-17的调节作用。结论/意义：我们的研究表明，在小鼠矽肺模型中Tregs通过调节TGF-1和IL-1能促进Th17细胞分化，从而进一步了解硅肺的进展，并提供Th17细胞通过Tregs在肺部炎症的调控机制的新见解。引言SiO2粒子的吸入引起硅肺，其特征在于肺部炎症和纤维化。硅肺的发病机制涉及不受控制的免疫过程。CD4+ CD25+ T细胞，称为Tregs，这是细

3、胞的稳定谱系在免疫耐受和免疫稳态的维持中起着抑制功能，但其作用在保护性免疫尚不完全清楚。在我们以前的研究中，我们报导了在矽肺中Tregs的关键作用是Tregs消除能减轻SiO2致肺纤维化的进展。在矽肺病患者中发现减少的频率和Tregs的功能。这些表明，Tregs在矽肺的发展中发挥着具有重要作用。Th17淋巴细胞，其分泌的IL-17A （也称为IL-17 ），IL- 17F和IL- 22 ，代表一个最近确定的Th细胞谱系，Th17通过招募中性粒细胞和其他细胞因子，在肺部的炎症和疾病中起着重要作用。 Th17细胞的分化需要TGF-，IL-6和/或IL-23。转录因子RORt介导其谱系提交。据报导，

4、Th17淋巴细胞在实验性硅肺中介导早期肺部炎症。Th17细胞和Tregs分别促进和抑制炎症反应。Tregs有抑制或促进Th17细胞反应的自相矛盾的能力。一些研究人员认为，Tregs或其他类型的T细胞能抑制Th17细胞的增殖。其他研究人员报告说，Tregs能促进Th17细胞的分化。在硅肺中Th17细胞分化背景相关机制及Tregs可能发挥的作用还不清楚。在这项研究中，我们使用抗CD25抗体，不断消除Tregs和评估矽肺的免疫反应。本研究的目的：（1）确定Th17细胞反应在硅肺中的作用;（2）阐明在实验性矽肺Tregs和Th17细胞之间的相互作用机制。Tregs消耗导致衰减硅肺中Th17的反应，这表

5、明Tregs能促进Th17细胞的急性反应和这个功能可能依赖于TGF-1和IL-1。结果在小鼠矽肺模型中Tregs消除增强中性粒细胞型炎症首先我们将C57BL/6小鼠注射抗CD25单克隆抗体PC61产生CD25+ T细胞消除。然后我们在注入生理盐水，SiO2和SiO2+抗-CD25单克隆抗体在第3、7、28和56天检测小鼠的肺对SiO2的反应。我们通过使用流式细胞仪检测脾脏中CD4+ CD25+Tregs的百分率确保CD4+ CD25+Tregs成功消除。注射抗CD25 单克隆抗体成功消除CD4+ CD25+Tregs（图S1A和1B）。Foxp3和CTLA-4，Tregs的功能表型，在脾脏对C

6、D4+CD25+ T细胞的表达，流式细胞仪（图S2 A-F）评估 HLN和BALF。注射抗CD25抗体有中和大部分的Tregs以及使Tregs失效的功能。与SiO2处理的动物相比，Tregs消除小鼠硅肺模型中支气管周围肺部炎症增加。在接受生理盐水的小鼠肺中未见明显异常（图1）（表1）。被评定为炎症有以下条件：0，无细胞浸润和肺泡变化；I，极少细胞浸润和肺泡壁增厚；II，轻微细胞浸润和肺泡壁增厚；III，中度细胞浸润和肺泡壁增厚；IV，严重的细胞浸润和肺泡壁增厚。考虑到在Tregs消除群体中严重的炎症和浸润细胞，我们检测炎性细胞（包括总细胞，巨噬细胞，淋巴细胞和嗜中性粒细胞）在肺泡盥洗液中的积累

7、。我们发现与生理盐水对照组相比，SiO2处理组和Tregs消除组有更多的炎症细胞浸润（图2A）。在第3天Tregs消除的小鼠与用SiO2处理的小鼠相比巨噬细胞的数目明显减少（图2B）。在SiO2处理组与Tregs消除组之间的淋巴细胞数没有差别（图2C）。然而，在第3天Tregs消除的小鼠与SiO2处理的小鼠进行比较嗜中性白细胞积聚显著增强（图2D）。这些结果表明，Tregs的消除增强了SiO2诱导的肺纤维化早期阶段中性粒细胞型炎症。在小鼠矽肺模型中Tregs消除降低Th17细胞反应为了证明Th17细胞在矽肺炎症的作用，我们提取肺组织总RNA和通过实时RT-PCR检测RORt。RORt是Th17

8、细胞一个关键转化生长因子。在各时间点，尤其在第7天和第28天SiO2处理组中RORt的mRNA表达明显高于生理盐水对照组（图3A）。IL-17A，Th17细胞的主要效应器细胞因子，并且通常称为IL-17，也在大大增加，并在第3天及第7天达到最高水平（图3B）。相反，在第7天和第28天Tregs消除组与SiO2处理组相比RORt的表达显著降低（图3A）。从第3天Tregs消除组比SiO2处理组IL-17A mRNA表达显著下降（图3B）。在SiO2诱导的肺纤维化模型中抑制Th17细胞的反应，这表明在Tregs消除组中Th17细胞和IL-17不参与严重中性粒细胞型炎症。接下来我们研究了Th17细胞

9、的免疫荧光定位。在肺组织切片通过共聚焦免疫荧光鉴定CD4+ IL-17A+细胞（黄色），数据分别为3天和第7天（图4）。我们观察到CD4+ T细胞（红色）渗透全肺。有些CD4+ T细胞表达IL-17A（绿色）。但不是所有的IL-17A+细胞由CD4表达。这些结果表明，Th17细胞不是IL-17的唯一来源。NK T细胞， T细胞及其他细胞可以分泌IL-17。特别在7天，CD4+ IL-17A+细胞的数量在SiO2处理组比生理盐水对照组高。在第3天和第7天，Tregs消除组与生理盐水对照组比较无显著差异。在第7天，Tregs消除组CD4+ IL-17A+细胞比SiO2处理组较低，但在第3天组无显著

10、差异（图4）。这些数据支持了在SiO2诱导的肺纤维化实验模型中Tregs促进作用Th17细胞的反应。鉴于RORt和IL-17A的表达与在上述SiO2处理组相比Tregs消除组显著下降，这些结果表明，Th17细胞和IL-17是不参与嗜中性粒细胞的累积和严重肺部炎症。在SiO2诱导的肺纤维化模型中Tregs对Th17细胞调节功能可能依赖于TGF-1和IL-1考虑到Tregs消除模型中Th17细胞的减少，我们推测到Tregs在Th17细胞的分化中起重要作用。我们测试了IL-10的水平，这可能抑制Th17细胞和TGF-，它可以与一些促炎细胞因子的协同促进Th17细胞分化，以确保Tregs是否通过IL-

11、10和/或TGF-1调节Th17细胞反应。观察到在SiO2处理的小鼠的肺匀浆物中IL-10 mRNA的表达增加和Tregs的消除导致IL-10表达减少的倾向。在第3天，三组之间无统计学差异（图5A），但统计学差异可以在其他时间点被发现。在SiO2处理组TGF-1mRNA表达水平与生理盐水对照组相比显著增加和与SiO2处理组相比，在Tregs消除组显著下降。在第3天,Tregs消除组和生理盐水对照组之间无显著差异（图5B）。在其他时间点，TGF-1 mRNA表达在SiO2处理组与在Tregs消除组相比增加。从免疫组织化学表明TGF-1与mRNA表达并联一个类似变化。阳性染色细胞在SiO2处理组中

12、分别比生理盐水对照组和Tregs消除组要高得多（图S3）。 ELISA法对IL-10和TGF-1的肺支气管肺泡灌洗也表现出了类似的蛋白水平（图5A和B）。所有的数据表明，在矽肺中TGF-1可能促进Th17细胞分化。IL-1能促进Th17细胞的分化。为了研究Tregs是否通过调节IL-1操纵Th17细胞分化，我们在小鼠的肺检查了IL-1 mRNA的表达。与生理盐水对照组相比，SiO2处理组和Tregs消除组表现出较高IL-1的表达水平。在所有时间点，在SiO2处理组IL-1水平明显高于生理盐水对照组。在第3、28和56天，与SiO2处理组相比，Tregs消除组IL-1的水平显著下降（图6A）。免

13、疫组织化学对IL-1还展示了三组之间的差异，阳性染色细胞在SiO2处理组和Tregs消除组增加，但在SiO2处理组更显著（图S4）。所有这些数据表明，在SiO2诱导的肺纤维化中，SiO2处理组IL-1分泌增加和在Tregs消除组IL-1水平减少。这表明，在SiO2诱导的肺纤维化中Tregs通过IL-1依赖的方式调节Th17细胞分化。然后我们研究了细胞因子IL-6，在TGF-与IL-23的存在下，其可以促进Th17细胞的分化，这对Th17细胞的维持和增殖很重要。在第3天和7天，Tregs的消除导致IL-6的表达显著增加（图6B）。在第28天及56天，IL-6的水平逐渐降低。在第28天，与SiO2

14、处理组相比，Tregs消除组的IL-6表达显著降低。虽然IL-6表达在没有Tregs下增加，Th17细胞分化仍然受到抑制。这些数据表明，促炎细胞因子IL-6不参与Tregs消除组Th17细胞的减少。与生理盐水对照组相比，Tregs消除组和SiO2处理组的IL-23的表达显著增加。在3天IL-23达到最高点，然后逐渐下降。在第3天和7天，在Tregs消除组的IL-23表达水平比在SiO2处理组略高（图6C），这表明，IL-23在矽肺中不是由Tregs调节的。在小鼠SiO2诱导的肺纤维化模型中，IL-6和IL-23似乎独立于Tregs对Th17细胞的调制。Th1和Th2细胞，显示在SiO2颗粒诱导

15、的肺纤维化的一些研究中。Th免疫反应受益于嗜中性粒细胞在SiO2诱导的肺部炎症的积累。因此，我们测试了IL-2，IFN-和IL-12的Th1和IL-4的Th2细胞，更有助于在不存在Tregs下探讨炎症的主要类型。在第3天，与SiO2处理组和生理盐水对照组相比，IL-2的表达在Tregs消除组显著增加。在SiO2处理组和生理盐水对照组之间IL - 2表达无差异（图7A）。 与生理盐水对照组相比，IFN- 的表达在Tregs消除组和SiO2处理组增加，但仅在Tregs消除组显著增加（图7B）。在第3天，与生理盐水对照组相比，IL-12的mRNA表达在SiO2处理组和Tregs消除组中显著增加（图7

16、C） 。 IL-4的mRNA表达，其所表示Th2细胞因子，在Tregs消除组显著下降（图7D）。在SiO2处理组和调Tregs消除组中 ，ELISA检测IFN -还显示了较高的蛋白质水平，但SiO2处理组和Tregs消除组间无显著差异（图S5 C） 。IL-4的水平在Tregs消除组明显低于二SiO2处理（图S5 D）。这些结果表明， Th1细胞和/或Th1型细胞因子受益于在Tregs消除的SiO2诱导的肺纤维化实验模型中的严重中性粒细胞炎症；Th1型细胞因子可以抑制Th17细胞的分化，Th1细胞因子的增强可能抑制Th17细胞的分化和IL-17的分泌。讨论 硅肺是一种由吸入硅尘引起并以肺部炎症

17、和纤维化为特征的职业性肺病。矽肺的发病机制涉及在SiO2粉尘沉积区域肺泡细胞损伤和激活后的细胞因子信号传导和细胞募集。T淋巴细胞在矽肺的发病机制中起重要作用。其作用及其与肺纤维化发展之间的相互影响仍然需要探讨。在这项研究中，我们证实了SiO2可诱导肺部炎症中Th17反应和在SiO2诱导的肺纤维化模型中Tregs消除降低Th17细胞分化和IL-17的分泌。在小鼠对SiO2粒子的异常修复和纤维化模型中Tregs可通过能调节TGF-1和IL-1来影响Th17细胞分化。在这项研究中，我们使用了一个通过注射抗CD25单克隆抗体（ PC61 ）来中和CD4+ CD25+Tregs来确定Tregs消除的小鼠

18、模型。 Tregs功能表型Foxp3的水平在Tregs消除的小鼠中减少，这些发现是由实时PCR和这篇文章和文献所描述的流式细胞仪证实。这些结果与抗CD25单抗选择性消除表达CD25 的最高水平的这些细胞一致，最近一些人证实了主要包括Foxp3的表达细胞。可能有一些CD25 - Foxp3+ Treg细胞和抗CD25单克隆抗体不能完全中和CD4+ CD25+Tregs 。然而，根据我们在现阶段的知识，我们认为抗CD25单克隆抗体的应用仍然是一个常用的方法，它是用来消耗体内的天然Tregs。然后，在第3、7、28和56天，我们用光镜检查了肺组织细支气管周围的炎症。在第3、7 、28和56天，与Si

19、O2处理组相比，Tregs消除组有更多的细胞浸润和严重的肺泡变化。然后，我们计算了在小鼠肺泡灌洗液炎性细胞数量，以弄清什么种类的细胞负责Tregs消除组严重炎症。大量研究表明，巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞对矽肺早期肺部炎症是重要的。然而，我们发现中性粒细胞但不是巨噬细胞或淋巴细胞负责Tregs消除组早期阶段的严重性炎症。嗜中性粒细胞在矽肺炎症损伤DNA和肺上皮细胞发挥了重要作用，这将触发的Th免疫反应，并负责矽肺早期肺部炎症。接下来，我们要研究在矽肺中Th17细胞反应。在一些肺疾病的模型中， Th17细胞和/或IL- 17通过招募中性粒细胞和其它细胞因子介导肺部炎症特别是在早期阶段。有些研究

20、团体已经表明， Th17细胞极化的免疫反应存在于小鼠肺部炎症模型。 Th17细胞反应在实验性矽肺炎症中被确定。因此我们检测了RORt和IL-17A ， Th17细胞的关键转化生长因子和Th17细胞的主要功能细胞因子。在SiO2诱导的肺纤维化炎性阶段 RORt和IL-17A的表达显著增加，这证实了其他结果，在SiO2诱导的肺纤维化Th17反应增加。但是RORt和IL- 17A的增加趋势是不一样的。 RORt水平逐渐升高，并在第28天达到最高点。 IL-17A的水平在第7天显著上升。这种现象可能是因为IL-17不是单独由Th17细胞分泌。免疫荧光结果表明CD4+ IL-17A+细胞（黄色）在SiO

21、2处理组明显多于其他两个组。我们的研究结果证实，在矽肺炎症中Th17细胞反应增加。但与SiO2处理组相比，RORt和IL-17A的水平Tregs消除组显著下降。因此，在SiO2诱导的肺纤维化Tregs消除降低了Th17细胞的反应。这些结果表明，Th17细胞和IL-17是不负责Tregs消除组中严重中性粒细胞炎症，这也证实了由上述免疫荧光法检查，在Tregs消除组所观察到的CD4+ IL-17A+细胞（黄色）的减少和CD4+ T淋巴细胞（红色）的增加。为了研究在矽肺中如何Tregs调节Th17细胞分化的机制，我们首先研究了细胞因子IL- 10和TGF -1 ：两个Tregs分泌的关键功能因子并且

22、在Th17细胞增殖中发挥重要作用。在第3天，IL-10 mRNA在3个实验组之间没有统计学差异，通过ELISA证实IL-10在3个组之间有差异。考虑到我们前面的工作，抑制性细胞因子IL- 10在SiO2处理组中显著增加，我们有有理由相信，Tregs并没有在SiO2诱导的肺纤维化依赖IL- 10的方式操纵Th17细胞反应。 TGF -1，也是Tregs的主要功能细胞因子能够促进Th17细胞分化，可能会影响Th17细胞在实验性矽肺的炎症中的进程。在这里我们表明，GF -1 mRNA在Tregs消除组比在处SiO2理组减少，这可能会导致Th17细胞和IL- 17的该组中的减少。通过免疫组织化学和EL

23、ISA法也证明了三组之间TGF -1的差异。因此，Tregs可能依赖TGF -1方式在SiO2诱导的肺纤维化实验模型中调控Th17细胞分化。为了控制增强的Th1和Th2应答，Tregs是必需的。如果没有Tregs及其细胞因子的调节功能，Th1细胞和/或Th2细胞可能扩大，并从SiO2致肺纤维化更严重的中性粒细胞炎症中受益。在第3天，与在SiO2处理组相比，Tregs消除组Th1型细胞因子的表达显著增加，Th2细胞因子的表达下降。之前我们已经报道了在SiO2诱导的肺纤维化的肺部炎症中Tregs可以通过抑制Th1反应来调节Th1/Th2极化。因此，我们认为典型的Th1反应，而不是Th17细胞和Th

24、2反应在Tregs消除小鼠矽肺模型的炎症阶段占主导地位。许多研究已证明Th1细胞因子对Th17细胞反应有抑制功能。我们的研究结果还表明，增加Th1细胞反应可能抑制Tregs消除小鼠矽肺模型中Th17细胞的反应。在肺纤维化的发展中IL- 1和NALP3炎性体的关键功能被证实之前。一些研究表明，由巨噬细胞吞噬的SiO2粒子会引发的IL -1的分泌。一些研究表明IL-1在促进Th17细胞反应关键作用。在这方面，SiO2粒子会通过促进IL -1分泌诱导Th17细胞分化。在SiO2处理组中较高的IL - 1 mRNA的表达和蛋白水平可能会在SiO2诱导的肺纤维化中诱导Th17炎症。考虑巨噬细胞数量在Si

25、O2处理组增加，我们有理由相信，它可能在SiO2诱导的肺纤维化实验模型中以SiO2 - 巨噬细胞-IL- 1- Th17细胞的方式负责Th17细胞分化。IL -1 表达水平在Tregs消除组比在SiO2硅处理组显著下降，这表明在SiO2诱导的肺纤维化实验模型中Tregs消除减少了IL -1的分泌。这些结果表明，Tregs消除可能通过降低IL -1分泌降低Th17细胞反应。因此，在SiO2诱导的肺纤维化中Tregs可能通过调节巨噬细胞-IL- 1- Th17细胞通路促进Th17细胞的反应。那么我们研究了炎性细胞因子IL-6和IL-23，它们招募中性粒细胞并且促进Th17细胞分化和成熟。我们的结果

26、表明，在早期阶段，IL-6和IL-23的表达在Tregs消除组和SiO2处理组较高，这表明在两组中IL-6和IL-23可能有助于早期中性粒细胞炎症，尤其在Tregs消除组。而在Tregs消除组IL-6和IL-23的表达升高并没有伴随着该组Th17细胞的反应加强。因此，在实验性矽肺模型中IL-6和IL-23可能不负责Th17细胞的降低。这些数据还显示，IL-6和IL-23可能在SiO2诱导的肺部炎症和纤维化以IL-1不同方式影响Th17的反应。总之，我们的研究结果表明，在肺部炎症中SiO2可诱导Th17反应和在SiO2诱导的肺纤维化Tregs消除降低了Th17细胞分化和IL-17的分泌。Treg

27、s可通过调节TGF-1和IL-1来调节Th17细胞分化但不是通过IL-6或IL-23。这些发现让我们进一步对矽肺的进展情况的了解，并提供了通过Tregs在肺部炎症Th17细胞的调控机制的新见解。材料和方法小鼠 6-8周龄的健康雌性C57BL/6小鼠，从SLAC实验动物有限责任公司购买。（上海，中国）。所有动物被安置在一个无特定病原体环境中并饲喂标准鼠粮，自由摄取食物和水。所有实验动物由中国医科大学动物护理和使用委员会批准，许可证号为CMU62043013，实验动物的护理和使用符合健康指南研究所。SiO2的制备SiO2是从Sigma公司购买(St., Louse, MO, USA)。SiO2粉尘

28、含量99，而80的SiO2粉尘的粒直径为1至5之间。SiO2在生理盐水中研磨3小时，在1N HCl中煮，洗涤，干燥，悬浮于无菌盐水中。悬浮液在使用前超声处理10min。SiO2的暴露60只小鼠随机分为3组（n=20）如下：SiO2+抗CD25单克隆抗体组，SiO2组和生理盐水对照组。动物腹腔注射2%戊巴比妥钠45mg/Kg体重进行麻醉。切开颈部皮肤，钝性分离暴露气管。A 7号针头是用来插入气管跨口服。小鼠要么接受总体积100ml无菌生理盐水3mg SiO2悬浮液，或仅接受相同体积无菌生理盐水。缝合手术部位和用青霉素清理以及小鼠允许恢复，直到处死它们。CD4+ CD25+调节性T细胞消除从SiO

29、2+抗CD25mAb组或SiO2处理组和生理盐水对照组的小鼠，在SiO2 暴露之前仅一天腹腔注射100L抗CD25单克隆抗体（PC61）（BioLegend，11080 Roselle Street,San Diego，CA 92121）或注射磷酸缓冲液小鼠IgG1（BioLegend，11080 Roselle Street，San Diego，CA 92121）。并在SiO2 暴露后每7天腹腔注射100L PC61 或相同体积的小鼠IgG1 为了持续消除Tregs。支气管肺泡灌洗和细胞计数在3，7，28或56天，通过SiO2灌注或无菌生理盐水处理后处死小鼠。摘取肺，并在冷PBS清洗。通过插

30、气管获取支气管肺泡灌洗液（BALF），连续3次注入和提取1mL等份的无菌生理盐水。将BALF在41500rpm离心8min。红细胞裂解后，洗涤BAL细胞沉淀并重新悬浮于PBS中。总细胞计数采用标准血液学程序法。BAL的细胞离心涂片制备和用瑞姬萨染色方法。在200个细胞中巨噬细胞，嗜中性粒细胞或淋巴细胞使用标准形态学标准确定。病理检查 肺固定在4多聚甲醛的PBS。将组织包埋在石蜡中，切成6m厚的部分。组织切片用苏木精和伊红（HE）染色。炎症分级如下：0，无细胞浸润和肺泡的变化；I，极少细胞浸润和肺泡壁增厚；II，轻微细胞浸润和肺泡壁增厚；III，中度细胞浸润和肺泡壁增厚；IV，严重细胞浸润和肺泡

31、壁增厚。共聚焦免疫荧光法 以下用0.01M PBS（pH为7.4）洗涤两次，肺组织切片用山羊血清（Histostain-Plus Kits，ZSBG-BIO）阻断30min，以减少漂洗非特异性结合，然后与10g/mL PECY7-偶联的抗小鼠CD4抗体（BD Pharmingen，San Jose，CA，USA），在4过夜培养。再用 PBS洗涤三次后，将玻片与10g/mLAlexa Fluor 488 - 偶联的抗小鼠IL-17A抗体（eBioscience，San Diego，CA92121，USA），在室温下孵育2小时。 Th17细胞的定位由共聚焦激光扫描显微镜（TCS sp2/AOBS，

32、LEICA）观察和用Leica共聚焦软件包进行分析。免疫组化检测 脱蜡后，将切片阻断，然后与抗体（TGF-1 sc-146和IL-1 sc-7884，SANTA CRUZ BIO， United States）在4培育过夜。在用PBS洗涤三次后，将切片与第二抗体（Histostain-Plus Kits 9001，ZSBG-BIO）在37培养30 min。切片是由直立显微镜（Eclipse 80i，尼康）观察，并用NIS-Elements软件包进行分析。支气管肺泡灌洗液细胞因子酶联免疫吸附测定法 应用ELISA试剂盒（eBioscience，San Diego，CA92121，USA）检测，用

33、100-L包被抗体孵育每个孔板，4过夜。包被板用250mL缓冲液洗涤。然后用200L检测稀释液在室温阻断1h。洗涤，加入 100L不同浓度标准品或样品室温孵育2 h。洗涤，加入检测抗体100L室温孵育1h，然后加入辣根过氧化物酶100L室温30 min，加入100L底物室温孵育15 min，加入50L终止液终止反应，450 nm处读板和分析，联免疫吸附以一式三份进行。肺门淋巴结和脾脏细胞的分离纯化 用针收获和解剖肺门淋巴结（HLN），然后用0.25胰蛋白酶在37消化5 min。 3%胎牛血清的PBS中用于结束消化反应。在4中1500 rpm离心8 min。洗涤HLN细胞沉淀并重新悬浮于PBS中

34、。取出脾脏，在冷PBS中机械研磨和解离。裂解后，洗涤RBC、脾细胞并重新悬浮于PBS中。流式细胞仪技术使用FACSCantoII （ BD ，Franklin Lakes，CA，USA）系统进行细胞表面标志物表达分析。简要地说，BALF ， HLN和脾细胞重悬浮于PBS中，用纯化的抗小鼠CD16/CD32 （ eBioscience，San Jose，CA92121，USA）在4阻断10 min。然后细胞分别与抗小鼠PERCP-CD3（eBioscience，San Jose，CA92121，USA） ，抗小鼠PE- Cy7-CD4（eBioscience，San Jose，CA92121，U

35、SA） 和抗小鼠APC - CD25 （ eBioscience，San Jose，CA92121，USA ），于4避光孵育20 min。然后细胞表面染色，用3的FBS-PBS洗涤两次。 加入1mL工作液（ 0.25mL固定/透化浓缩物和0.75mL固定/透化稀释剂）（ eBioscience，Diego，CA 92121 ，USA） ）在4避光固定和渗透细胞膜30 min 。要标记核因子Foxp3，细胞与抗小鼠FITC-Foxp3 在4避光孵育1 h（ eBioscience，San Diego， CA 92121 ， USA ） 。此外，HLN和脾细胞与抗小鼠PE - CTLA-4 （ B

36、D Pharmingen，San Jose，CA，USA），在4避光孵育1 h。在此之后，将细胞用3% FBS-PBS洗涤两次，并悬浮在1 %多聚甲醛-PBS中。根据前锋散射（FSC）和侧散射（SSC）封闭死亡细胞。细胞用Diva软件进行分析。RNA提取和实时RT-PCR法 根据制造商的方案使用TRIZOL®试剂从肺匀浆中提取总RNA（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。 RNA浓度和260/280的比例由紫外分光光度计测定。在各时间点从每个处理组的每个动物的2 g总肺RNA反转录为20 L使用以下程序的体积：37 15min，85 5s。对IL-12，IL-23

37、和RORt，反转录的cDNA根据使用下列引物制造商的指示由SYBER Green技术ABI7500系统（Applied Biosystems）检测，使用下列引物： IL-23 ,正向 5，-ACATGCACCAGCGGGACATA-3，； 反向 5，-CTTTGAAGATGTCAGAGTCAAGCAG-3，；IL-12 ,正向 5，-TGTCTTAGCCAGTCCCGAAACC-3，； 反向 5，-TCTTCATGATCGATGTCTTCAGCAG-3，；RORt ,正向 5，-ACGGCCCTGGTTCTCATCA-3，； 反向 5，-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3，；引物和TaqMan探针与引物3用于设计其它一些基因（）以及对序列进行比对（）。引物序列如下：IL-12 ,正向 5，-TTGAGTGCCAATTCGATGATGAG-3，； 反向 5，-TTGAGATGATGCTTTGACAGAAGG-3，；IFN- ,正向 5，-AAGCGTCATTGAATCACACCTG -3，； 反向 5，-TGACCTCAAACTTGGCAATACTC-3，；IL-4 ,正向 5，-AAAATCACTTGAGAGAGATCATCG