选修一课题3分解纤维素的微生物的分离

1、 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。能力。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡

2、萄糖纤维素纤维素滤滤纸纸崩崩溃溃法法纤维素酶活性的测定实验：纤维素酶活性的测定实验：取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸

3、条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？ 在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的都能维持相同的pH。思考思考1实验分析：实验分析：P27的的小实验是如何构成对照的？小实验是如何构成对照的？l本实验的自变量是本实验的自变量是纤维素酶纤维素酶的有无的有无l自变量的操纵方法是：在自变量的操纵方法是：在一一支试管中添加适量（支试管中添加适量（1mL1mL）的）的纤维素酶溶液纤维素酶溶液

4、，在，在另一支试管另一支试管不添加纤维素酶不添加纤维素酶，但需加入等，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的否则会影响溶液的pHpH。实验分析：实验分析：P P2727的小实验中的的小实验中的自变量是什么？自变量是什么？下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A. B.C. D.C 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的素酶而分解纤维素，而人没有分

5、解纤维素的能力。能力。刚果红染色法刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选接对微生物进行筛选 。 即：可根据是否产生透即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。明圈来筛选纤维素分解菌。( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样?选择培养基选择培养基的特点的特点? ?培养的目的培养的目的? ?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养鉴别培养基的特点基的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?本实验流程与课题本实验流程与课

6、题2 2中实验流程有哪些异同中实验流程有哪些异同? ?前者直接稀释涂布在以尿素为唯一前者直接稀释涂布在以尿素为唯一N N源的选择培养基上，源的选择培养基上，直接分离得到目的菌落；后者先进行选择培养，使纤维直接分离得到目的菌落；后者先进行选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液稀释涂布到选择培养基素分解菌得到增殖后，再将菌液稀释涂布到选择培养基 纤维素分解菌大多分布在纤维素分解菌大多分布在_的环境中。采集土样时，的环境中。采集土样时，应选择富含纤维素的环境。如树林应选择富含纤维素的环境。如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。也可将滤纸埋累的枯枝败

7、叶等等。也可将滤纸埋在土壤中一个月左右，这样会有能在土壤中一个月左右，这样会有能分解纤维素的微生物生长。分解纤维素的微生物生长。【资料一资料一】土壤取样土壤取样 富含富含纤维素纤维素旁栏思考题旁栏思考题为什么要在富含纤为什么要在富含纤维素的环境中找纤维素分解菌？维素的环境中找纤维素分解菌？ 根据生物与环境的互相依存根据生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。的几率要高于普通环境。旁栏思考题旁栏思考题 人工设置适宜环境，使纤人工

8、设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约于深约10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。1、纤维素分解菌选择培养基属于、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，（固体、液体）培养基，原因是原因是_。【资料二资料二】选择培养选择培养阅读资料二阅读资料二“选择培养基选择培养基”，回，回答以下几个问题：答以下几个问题：液体液体没有添加琼脂成分没有添加琼脂成分2、该培养基对微生物、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是果具有，其选择机制是_。以纤维素粉为唯一碳源，能分解以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微

9、生物可以大量繁殖纤维素的微生物可以大量繁殖 具有具有 若设置一个对照实验说明选择培若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将养的作用，应控制的变量是将_改为改为_。3、你能否设计一个对照实验，、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？说明选择培养基的作用？葡萄糖葡萄糖纤维素粉纤维素粉思考思考2实验流程中实验流程中“选择培选择培养养” 的目的是什么？的目的是什么？ 其目的是增加纤维素分解其目的是增加纤维素分解菌的浓度，菌的浓度，以确保能够从样品以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。中分离到所需要的微生物。选择培养的操作方法选择培养的操作方法 将土样加入装有将土样加入装有30m

10、l选择培选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培在摇床上，在一定温度下震荡培养养12天，直至培养液变浑浊。天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。也可重复选择培养。旁栏思考题旁栏思考题为什么选择培养能为什么选择培养能够够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。

11、纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择培养基选择培养基与与鉴别培养基鉴别培养基的比较的比较选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基物理物理性质性质唯一唯一C C源源作用作用液体培液体培养基养基固体培固体培养基养基纤维素纤维素CMC-Na使纤维素分解使纤维素分解菌迅速增殖菌迅速增殖鉴别与筛选纤鉴别与筛选纤维素分解菌维素分解菌 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基概念概念用途用途例子例子培养基中加入某种化学培养基中加入某种化学物质，促进所需要的微物质，促进所需要的微生物生长，抵制不需要生物生长，抵制不需要的微生物的生长的微生物的生长根据微生物的代谢根据微生物的代谢特点，在培养基中特点，在培养基中加

12、入某种指示剂或加入某种指示剂或化学药品化学药品培养、分离出培养、分离出特定的微生物特定的微生物鉴别不同种类的鉴别不同种类的微生物微生物如培养酵母菌和霉菌，如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入可在培养基中加入青青霉素霉素用用伊红伊红- -美蓝美蓝培养培养基鉴别饮用水中是基鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌，否含有大肠杆菌，培养基按培养基按用途用途分类分类以下选择培养基可以分离哪些微生物？以下选择培养基可以分离哪些微生物？加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基杀死细菌、放线菌，分离酵母菌、霉菌等真菌杀死细菌、放线菌，分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基杀死多种微生物，分离出金

13、黄色葡萄球菌杀死多种微生物，分离出金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基分离出自生固氮菌分离出自生固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基分离出自养型微生物分离出自养型微生物以纤维素作为唯一以纤维素作为唯一C源的培养基源的培养基分离纤维素分解菌分离纤维素分解菌以尿素作为唯一以尿素作为唯一N源的培养基源的培养基分离尿素分解菌分离尿素分解菌大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂培养基上典型特征培养基上典型特征 四种四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈纤维素分解菌在刚果红培养基上

14、形成的透明圈101102103104105106梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上分解菌的培养基上1. 制备培养基制备培养基:参照旁栏中的比例参照旁栏中的比例2. 涂布平板：涂布平板：将稀释度为将稀释度为104106的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，涂布在培养基上，30倒置培养倒置培养挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落 挑取产生明显的透明圈的菌落，挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在基上，在30300 0C C 37370

15、 0C C培养，可获得纯培养，可获得纯培养。培养。【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法思考思考1这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法优点优点缺点缺点方法一方法一 方法二方法二 颜色反应基本上是纤颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用维素分解菌的作用1、操作繁琐、操作繁琐2、刚果红会使菌落之、刚果红会使菌落之间发生混杂间发生混杂操作简便，不存操作简便，不存在菌落混杂问题在菌落混杂问题1.产生淀粉酶的微生物也产生产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，产生假阳性反应模糊透明圈，产生假阳性反应2.有些微生物能降解色素，在有些微生物能降解色素，在培养过程中可形成明显的透

16、明培养过程中可形成明显的透明圈。圈。 漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈

17、洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！当然分解纤维素的能就强！ 方法一加入中方法一加入中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考思考2四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由

18、于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。 为了确定分离得到的是纤维素为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和发酵和_ 发酵。纤维素发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的等纤维素所产生的_ 含量进含量进行

19、定量测定。行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些中的实验流程有哪些异同？异同？ 本实验流程与课题本实验流程与课题2 2

20、的流程的区别如下。课的流程的区别如下。课题题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌得到菌落。本课题通过落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。他步骤基本一致。 比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲

21、酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法课题课题2和课题和课题3的鉴别方法有何区别？的鉴别方法有何区别？练一练：练一练：1 1、下列关于纤维素酶的说法，错误的是、下列关于纤维素酶的说法，错误的是A A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁、纤维素酶可用于去掉