蛋白质组学-LDH

1、蛋白质组学Proteomics刘丹慧温州医学院检验医学与生命科学学院p蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者。命活动的实际执行者。 p几乎所有的生物催化剂几乎所有的生物催化剂-酶，都是蛋白质。构成酶，都是蛋白质。构成细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分也是由蛋白质组成。肌肉大部分也是由蛋白质组成。p蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再

2、折叠形成一定空间结构。肽链再折叠形成一定空间结构。前言与背景前言与背景 100,000 proteins3 billion bases28,000 genes 人类基因组中绝大部分基因及其功能有人类基因组中绝大部分基因及其功能有待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。 基因组基因组 转录组转录组 蛋白质组蛋白质组The era of omics-based science （组学时代组学时代） Genomics （基因组学基因组学） Post-genomic science （后基因组时代后基因组时代）Functional genomics （功能基因组学功能基因组

3、学）Transcriptomics（ 转录组学转录组学）Proteomics （蛋白质组学蛋白质组学）Metabonomics/metabolomics （代谢组学代谢组学）Structural genomics （结构基因组学结构基因组学）Aim - 3D structures of all protein folds !基因组告诉你，理论上能够发生什么？基因组告诉你，理论上能够发生什么？mRNA告诉你，可能发生什么？告诉你，可能发生什么？蛋白质组告诉你，正在发生什么？蛋白质组告诉你，正在发生什么？蛋白质组（蛋白质组（proteome） ： 1994年，由年，由Marc Wilkins首次提

4、出，指由首次提出，指由一个基因组一个基因组(genOME)，或一个细胞、组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质织表达的所有蛋白质(PROTein)。3.1.2 蛋白质组蛋白质组蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics）：）： 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。活动规律。3.1.3 蛋白质组蛋白质组学学功能蛋白质组：功能蛋白质组：

5、细胞在某一阶段或与某一细胞在某一阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。生理现象相关的所有蛋白质。差异蛋白质组：差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样不同种类或状态下各种样本之间蛋白质组的区别与变化本之间蛋白质组的区别与变化。3.2 蛋白质组学的研究蛋白质组学的研究多样多样-蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质数目大大超过基因数目。可变可变-蛋白质随时间与空间变化。蛋白质随时间与空间变化。3.2.1 蛋白质组学研究的基本流程蛋白质组学研究的基本流程基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程泛的、发展最为成熟的工作流程2-DE & MS

6、样品制备样品制备样品来源：细胞、组织、体液等。样品来源：细胞、组织、体液等。可采用全蛋白；可采用全蛋白； 或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜蛋白、核蛋白等）膜蛋白、核蛋白等）- 提高低丰度蛋白质的上提高低丰度蛋白质的上样量及检测灵敏度。样量及检测灵敏度。p尽可能扩大尽可能扩大蛋白质的蛋白质的溶解度和解聚，以提高分溶解度和解聚，以提高分辨率。辨率。样品分离样品分离双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）：利用蛋白质：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。的等电点与分子量差异分离之。第一

7、向：等电聚焦第一向：等电聚焦 IEF 第二向：第二向：SDS-PAGE第一向第一向 等电聚焦等电聚焦IEF第二向第二向 SDS-PAGE染色方法染色方法考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色银染（不含戊二醛）银染（不含戊二醛）荧光染色（荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标），放射性同位素标记等记等2-DE 的缺点的缺点难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。小蛋白质，及低丰度蛋白质。胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。动化联用。新型非凝胶技术新型非凝胶技术 液相色谱法（液相色谱

8、法（liquid chromatography, LC） 对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效的分离鉴定白进行有效的分离鉴定。LC-MS/MS：液质联用技术Cell cultureProtein extraction2-DEstaining Image analysisScanning微量测序（微量测序（microsequencing） N-末端末端 Edman 降解降解：经凝胶分离的蛋白质直接经凝胶分离的蛋白质直接印迹在印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上膜或玻璃纤维膜上

9、N末端氨基酸末端氨基酸残基经苯异硫氰酸酯修饰残基经苯异硫氰酸酯修饰 从多肽链上切下修饰从多肽链上切下修饰的残基的残基 再经层析鉴定再经层析鉴定 余下的多肽链被回收余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。再进行下一轮降解循环。 缺点：过程缺点：过程缓慢，消耗大缓慢，消耗大，试剂昂贵试剂昂贵。质谱分析（质谱分析（Mass spectrometry） 基本原理：基本原理：样品分子离子化后，根据离子样品分子离子化后，根据离子间质荷比（间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分）差异来分离并确定样品分子量。子量。InletIonizationMass AnalyzerMass Sorting (filte

10、ring)Ion DetectorDetectionIon SourceSolidLiquidVaporDetect ionsForm ions(charged molecules)Sort Ions by Mass (m/z)1330134013501007550250Mass Spectrum主要质谱类型主要质谱类型 MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时电离飞行时间质谱间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) ESI MS: 电喷雾

11、质谱电喷雾质谱（ electrospray ionisation mass spectrometry ） MALDIl 利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。l MALDI 最大的特点是离子电荷通常为最大的特点是离子电荷通常为1-2个，个，而不象而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样中为多电荷离子，对分子质量较大的样品而言，不会

12、形成复杂的多电荷图谱，因而对图品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图谱的解析比较清楚谱的解析比较清楚。ESI 待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发，在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发，其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。l 没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较没有

13、直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的少，是一种典型的“软电离软电离”方式。方式。 l 可形成多电荷离子，因此在较小的可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质 量量100 kDa以下的蛋白质，最高可达以下的蛋白质，最高可达150 kDa。l由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用，即液相色谱联用，即液相色谱-电喷雾质谱电喷雾质谱 (LC-ESI MS)。l在常规电喷雾质谱中，喷雾的

14、过程易形成较大液滴，液在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液 滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低 了样品的利用率和灵敏度。了样品的利用率和灵敏度。 电喷雾源电喷雾源(ESI)的特点的特点 鉴定与注释蛋白质的路线鉴定与注释蛋白质的路线 通过肽指纹图谱（通过肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）和数据库搜寻匹配）和数据库搜寻匹配 通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配MALDI-TOF/TOFLC

15、-MS/MSPMF +TOF MS: 180 MCA scans from Serum T 040703.wiffMax. 201.0 counts.1100120013001400150016001700180019002000210022002300240025000102030405060708095Intensity, counts1465.63731206.57651913.91601503.60721434.52262178.93361552.60421169.53361951.8651MS-MS 1205MS-MS 1465MS-MS 1913蛋白质数据库蛋白质数据库 目前应用最

16、普遍的数据库是目前应用最普遍的数据库是NRDB 和和dbEST 数数据库。据库。 NRDB 由由SWISS-PROT 和和GENPETP 等几个数据库组成；等几个数据库组成；dbEST是由美国国家生物技术信息中心（是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和）和 欧洲欧洲生物信息学研究所生物信息学研究所(EBI)共同编辑，包括大量肽序列标签共同编辑，包括大量肽序列标签（PST）。）。 SWISS-PROT () 拥有目拥有目前世界上最大的蛋白质组学数据库。前世界上最大的蛋白质组学数据库。 PMF或二级质谱匹配检索常用搜索引擎或二级质谱匹配检索常用搜索引擎-

17、MASCOT (http:/)3.3 蛋白质组学研究平台蛋白质组学研究平台 抗体芯片抗体芯片 可用于可用于研究在不同生理状态或病理状态下蛋研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变白水平的量变。 优点：优点：微型化，集成化，高通量化。微型化，集成化，高通量化。 如肿瘤标志物抗体芯片等如肿瘤标志物抗体芯片等内源标准化处理内源标准化处理 常用荧光标记：常用荧光标记：Cy5和和Cy3等。等。酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）典型的真核转录因子都含有二个结构域典型的真核转录因子都含有二个结构域: DNA结结合结构域合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和和 转录激活结构域转录激活结构域（activation domain，AD） 。二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。合才具完整活性。酵母双杂交系统利用杂交基因