时间分辨荧光技术TRFIA技术培训资料PPT课件

1、 1;.2;.标记免疫技术的检测水平标记免疫技术的检测水平放射免疫放射免疫（精度：（精度：10-12mol/L ）酶联免疫酶联免疫（精度：（精度：10-9 mol/L ）化学发光化学发光（精度：（精度：10-15mol/L ）电化学发光电化学发光（精度：（精度：10-17mol/L ）时间分辨荧光（精度：时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ）3;.放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA）放免自放免自60年代问世以来对临床诊年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以夹心法、竞争法的标

2、记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。后的检测技术的发展奠定了基础。放射性（放射性（125 I），对环境的污染），对环境的污染及对身体的危害及对身体的危害125125 I 的半衰期短而导致其试剂有的半衰期短而导致其试剂有效期短效期短被标记物的稳定性差被标记物的稳定性差操作繁琐，费时操作繁琐，费时无法保存备用无法保存备用4;.酶免疫分析法（酶免疫分析法（ELISAELISA）酶免的最大优势在于避免了对环境酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害和人体危害试剂有效期较长试剂有效期较长曾经一度被认为是取代放免的检测曾经一度被认为是取代放免的检测手段手段灵敏度、重复性不及放免，易造成漏灵敏度、重复性

3、不及放免，易造成漏检和假阳性检和假阳性因酶的纯度和反应过程容易受环境因因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好素影响，导致稳定性不好5;.化学发光免疫分析法（化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassaychemiluminescent immunoassay）单个样本检测速度快，适合做急诊单个样本检测速度快，适合做急诊灵敏度较高灵敏度较高自动化程度高自动化程度高分类：分类：以丫啶酯直接标记以丫啶酯直接标记以以HRP标记，鲁米诺为发光底标记，鲁米诺为发光底物物Amerlite系统系统以以AP(碱性磷酸酶碱性磷酸酶 )为标记物，为标记物，AMPPD为发

4、光底物为发光底物样品不能重复检测样品不能重复检测本底较高本底较高仪器故障率较高仪器故障率较高试剂稳定性较差试剂稳定性较差检测精度不高，在超微量分析及早检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足期诊断方面能力不足非开放性试剂；试剂价格高非开放性试剂；试剂价格高6;.电化学发光免疫分析法（电化学发光免疫分析法（ECLECL）80年代末期问世的新型化学发光免疫年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法分析方法基本原理：根据三联吡啶钌基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较本底较小、灵

5、敏度较高、线性范围较宽宽以罗氏为代表以罗氏为代表非开放性试剂系统、不能做科研非开放性试剂系统、不能做科研试剂价格过高试剂价格过高7;.二、时间分辨荧光技术二、时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）8;.时间分辨荧光发展史时间分辨荧光发展史 1979 1979年，提出年，提出“时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析”理论，理论，19891989年该技术获诺贝尔化学奖年该技术获诺贝尔化学奖提名。提名。 90 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧

6、光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段9;.时间分辨免疫荧光技术的定义时间分辨免疫荧光技术的定义用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质物质当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反

7、应，经解离增增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的分析的目的10;.TRFTRF分析原理图（分析原理图（1 1）11;.12;.13;.14;.Eu标记物轻链轻链螯合剂螯合剂Eu重链重链15;.16;.17;.18;.仪器检测仪器检测19;.标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素 铕铕(Eu)(Eu)、钐（、钐（Sm)Sm)、镝、镝(Dy)(Dy)、锝、锝(Tb)(Tb)镧系元素

8、荧光特点：镧系元素荧光特点： 1 1、荧光寿命极长、荧光寿命极长镧系元素螯合物（镧系元素螯合物（6060900 us) 900 us) 714us普通荧光免疫中荧光团：普通荧光免疫中荧光团：1 1100us100us样本中蛋白质荧光：样本中蛋白质荧光：1 110us10us，易猝灭，易猝灭20;.利用镧系元素荧光物理特利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为光已完全衰减为0 0TRF分析原理图（分析原理图（2）21;.标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素

9、2 2、StokesStokes位移大位移大（大约（大约290nm290nm） 铕：激发光铕：激发光340nm340nm、发射光、发射光613nm613nm 荧光素的荧光素的StokesStokes位移为位移为280nm280nm3 3、荧光特异性强、荧光特异性强（发射光谱带很窄：（发射光谱带很窄：615615 5nm 5nm）4 4、解离、解离- -增强技术增强技术可使其荧光性提高可使其荧光性提高100100万倍万倍22;.巨大巨大StokesStokes位移位移发射光谱与激发光谱发射光谱与激发光谱间存在的巨大间存在的巨大StokesStokes位移。可以通过干涉位移。可以通过干涉滤光片将发

10、射光谱与滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离激发光谱完全分离23;.TRFIATRFIA为临床检测带来的先进性为临床检测带来的先进性技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发光分离发射荧光与激发光分离零背景、高特异性零背景、高特异性高灵敏度高灵敏度解离解离-增强增强荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围宽线性范围宽高灵敏度高灵敏度原子标记原子标记 标记位点多，可达标记位点多，可达20个个 对标记物结构及活性影响小对标记物结构及活性影响小 无衰变无衰变 受环境影响小受环境影

11、响小高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次可两点定标同一批次可两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目同一试剂盒可同时测多个项目24;.灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂试剂 DELFIA（WALLC） Immulite（DPC化学发光）化学发光） ACS-180(拜尔）拜尔） AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA

12、0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog0.08-120nmol/L 无无 0.1-40ng/ml Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml 25;.时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5

13、 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长标准曲线稳定，试剂保质期时间长26;.时间分辨荧光与化学发光方法学比较时间分辨荧光与化学发光方法学比较 发光效率发光效率 95%1% 重复检测重复检测 可无数次可无数次 不可重复不可重复本底噪声本底噪声 零本底零本底 干扰大干扰大灵敏级数灵敏级数 10-18 10-15标记物标记物 原子原子 大分子化合物大分子化合物标记位点标记位点 可达可达20个个/抗体抗体 1个个/抗体抗体标准曲线标准曲线 稳定达一年以上稳定达一年以上 稳定稳定 2 到到 4周周多标

14、记多标记 有，最多可达四标记有，最多可达四标记 无无科研开发科研开发 有有 无无27;.时间分辨荧光和电化学发光的比较时间分辨荧光和电化学发光的比较 标记物标记物四种原子四种原子: Eu, Sm, Tb, Dy一种原子一种原子: 钌钌多标记技术多标记技术 有有 无无做科研做科研能能(1000多种科研项目多种科研项目) 无无 试剂种类试剂种类58种临床种临床,24种科研种科研, 28种临床种临床, 无科研试剂无科研试剂 共共82种种试剂价格试剂价格 低低 高高28;.时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫-突出优点突出优点零本底、灵敏度高零本底、灵敏度高线性范围宽线性范围宽试剂有效期长试剂有效期长标准

15、曲线稳定性好标准曲线稳定性好易于自动化易于自动化对环境及人体没有任何影响对环境及人体没有任何影响TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。革命。29;.三、时间分辨荧光免疫技术三、时间分辨荧光免疫技术的临床应用的临床应用 (临床检测试剂盒简介临床检测试剂盒简介)30;.内分泌科检查 1 、甲状腺功能系列、甲状腺功能系列 T3 三碘甲状原氨酸三碘甲状原氨酸T4 甲状腺素甲状腺素FT3 游离三碘甲状原氨酸游离三碘甲状原氨酸FT4 游离甲状腺素游离甲状腺素TSH-U 促甲状腺素促甲状腺素(超敏感

16、超敏感)TBG Ab 甲状腺结合球蛋白甲状腺结合球蛋白TPO Ab 甲状腺过氧化物酶甲状腺过氧化物酶时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍31;.临床意义概述：临床意义概述： 甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，甚至危及前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，甚至危及生命。生命。以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全以上各项目的联合检测，为临床医生对病

17、患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。面的依据。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍32;.2 、糖尿病系列、糖尿病系列 InS 胰岛素胰岛素 CP C肽肽 临床意义概述：临床意义概述：了解残留胰岛了解残留胰岛细胞的功能，特别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病细胞的功能，特别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)(IDDM)和和非胰岛素依赖型糖尿病非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM);(NIDDM);用于胰岛素瘤的诊断等。用于胰岛素瘤的诊断等。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍33;. 时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪

18、器测定项目介绍3 、生长激素、生长激素 hGH 生长激素生长激素 临床意义概述：临床意义概述： 对诊断肢端肥大症是一项特异的方法；对诊断肢端肥大症是一项特异的方法； hGH低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如席汉综合征等。低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如席汉综合征等。34;.妇产科检查（性激素） hCG 绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素黄体生成素(特异性特异性) FSH 促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睾酮睾酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白性激素结合球蛋白时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧

19、光分析仪器测定项目介绍35;.时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述临床意义概述性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。动和生殖功能的一类甾体激素。检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。育工作的开展具有重要的意义。36;.肿瘤科检查 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原前列腺特异抗原 B2-M Be

20、ta 2微球蛋白微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Free / total 前列腺特异抗原前列腺特异抗原/总量总量时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍37;.临床意义概述：临床意义概述：肿瘤标志物（肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移

21、及判断预后等。对现有疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目进行综合分析、多元分析，项目进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的筛选出有价值的TM，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍38;.遗传科检查1 、产前筛查产前筛查 PAPP-A 妊娠相关血浆蛋妊娠相关血浆蛋 Free hCGBeta 游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性腺激素 亚单位亚单位 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 E3 游离雌三醇游离雌三醇h AFP/Free hCG 甲胎蛋白甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性

22、腺激素 亚单位亚单位 临床意义概述：临床意义概述： 是预防患有严重遗传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项有效措施。随着产前诊断是预防患有严重遗传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项有效措施。随着产前诊断技术的不断完善，产前诊断不仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在技术的不断完善，产前诊断不仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在分娩过程中和分娩后给予合适的处理。分娩过程中和分娩后给予合适的处理。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍39;.时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2 、新生儿筛查、新生儿筛查 Neoneotal hTSH 新生儿筛

23、查促甲状腺素新生儿筛查促甲状腺素 Neoneotal T4 新生儿筛查甲状腺素新生儿筛查甲状腺素 Neoneotal 17 -OH-Prog 17-羟基酮羟基酮 Neoneotal PKU 新生儿筛查苯丙氨酸新生儿筛查苯丙氨酸临床意义概述：临床意义概述：通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病，从而通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病，从而早期诊断、早期治疗，避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育障碍早期诊断、早期治疗，避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育障碍甚至死亡。甚至死亡。40;.血液科检查1 、贫血检查贫血检查 Ferrit

24、in 铁蛋白铁蛋白 Vit B12 维生素维生素B12 folate 叶酸叶酸2 、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等其它科研时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍41;.时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍传染科检查 乙肝系列乙肝系列 HBsAg 表面抗原表面抗原 HBsAb 表面抗体表面抗体 HBeAg e抗原抗原 HBeAb e抗体抗体 HBcAb 核心抗体核心抗体 开发中：抗开发中：抗HBcIgM 临床意义概述：临床意义概述：为 乙 型 肝 炎 临 床 早 期 诊 断 和 治 疗 提 供

25、病 原 学 依 据 。为 乙 型 肝 炎 临 床 早 期 诊 断 和 治 疗 提 供 病 原 学 依 据 。能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义。有重要意义。42;.泰莱泰莱-I-I型时间分辨系统型时间分辨系统43;.泰莱泰莱-型时间分辨系统型时间分辨系统44;.使用使用TRFIATRFIA的理由的理由一、专为中国医院量身定制一、专为中国医院量身定制仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各级医院开展高灵敏度的特种仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各级医院开展高灵敏度的特种检验提供可行、低成本