21抑制剂联合伊马替尼对慢性粒系白血病K562细胞增殖的作

1、MicroRNA-21抑制剂联合伊马替尼对慢性粒系白血病K562细胞增殖的作用赵广富1，朱贵华1，苏林2（1.连云港市第二人民医院，江苏连云港 222023；2.中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所，北京100005）摘要：目的 探讨microRNA-21基因拮抗联合酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖及周期的调控作用。方法 在293TN细胞中包装并收获可以抑制内源microRNA-21表达的重组慢病毒颗粒，进行病毒滴度测定后，感染K562，经流式分选得到GFP阳性的K562细胞株。Northern blot证实感染后microRNA-21的表达，MTT法检

2、测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期。结果 Northern blot证实K562细胞中microRNA-21的表达水平与正常人外周血细胞相比明显升高。抑制microRNA-21表达的K562细胞株生长速度明显减慢，细胞周期运行也受到阻滞；伊马替尼作用于microRNA-21表达抑制的K562细胞后，细胞增殖与伊马替尼单独作用的K562细胞及单独抑制microRNA-21表达的K562细胞相比均明显降低，周期也受到更严重的阻抑。结论 在K562细胞中联合使用拮抗microRNA-21表达和酪氨酸抑制剂伊马替尼能够协同抑制细胞增殖及细胞周期运行。关键词：microRNA-21; 伊马替尼; K5

3、62;Effect of micorRNA-21 inhibitor combined with imatinib on chronic myeloid leukemia K562 cell growthZHAO Guang-fu1, ZHU Gui-hua1, SU Lin2(1.Lianyungang Second Peoples Hospital, Lianyungang Jiangsu 222023; 2.Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Peking Union Medical College (PUMC), Beiji

4、ng 100005)Abstract：Objective To study the roles of microRNA-21 in cooperation with imatinib in a chronic myeloid leukemia cell line K562.Methods The recombinant lentivirus particles (pMIRZip-miR-21 and control pMIRZip vector) were harvested from 293TN cells and added to the medium with cultured K562

5、 cells. K562 cells expressing GFP were selected by flow cytometry. The expression of microRNA-21 was detectable by Northern blot. The cell proliferation was tested by MTT, and the cell cycle was measured by flow cytometry.Results MicorRNA-21 was significantly up-regulated in K562 cells compared with

6、 peripheral blood cells from normal. Inhibition of micorRNA-21 in K562 cells decreased cell proliferation and cell cycle progression. The growth of K562 cells tranduced with Lenti-miR-21 was markedly inhibited after imatinib treatment. Moreover, The percentage of cells at G0/G1 phase greatly increas

7、ed after transduction with Lenti-miR-21 to K562 combined with imatini.Conclusion The inhibition of micorRNA-21 in combination with imatinib has a synergistic effect on the proliferation and cell cycle progression of K562 cells.Key words:microRNA-21;imatinib;k562 ; micorRNA（小RNA）是近年来新发现的一类调节分子，它通常通过与

8、靶mRNA分子互补结合使mRNA的翻译受阻或使靶mRNA降解而抑制其表达1。microRNA所介导的转录后调控已经成为公认的真核生物基因表达调控网络的重要组成结构，并与转录因子、表观遗传调控因子等协同作用共同完成复杂生命活动的调节。已有的研究结果证明microRNA的作用深入到了生命活动的各个方面，包括组织器官发育、细胞增殖和凋亡、能量代谢、细胞迁移和病毒感染等等2,3。而且越来越多的证据表明许多microRNA参与了肿瘤的发生和发展，相应地，在体外和动物体内也有实验证实通过外源干预microRNA的表达可以达到抑制肿瘤细胞生长的目的2-4。最近，有报道指出microRNA-21在慢性髓系白血

9、病（CML）患者中表达显著上升，使用体外合成的microRNA-21抑制剂转染人慢性髓系白血病细胞系K562，能够抑制细胞的增殖和迁移，说明拮抗microRNA-21在CML治疗中的潜在价值5。伊马替尼是传统的CML治疗药物，但也存在耐药复发的问题，因此，寻找新的CML治疗靶点，并实验联合用药对于极大程度上缓解CML具有重要意义。本研究在了解microRNA-21参与CML发生发展的分子机制基础上，实验microRNA-21抑制剂联合伊马替尼对髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响，为microRNA应用于白血病的临床治疗，以及将microRNA与传统化疗药物联合使用提供依据。1 材料与方法

10、 1.1 材料1.1.1主要药物及试剂伊马替尼(瑞典Novartis公司赠送)，用三蒸水配制成1mmolL溶液，过滤除菌。CML急变期细胞株K562由中国医学科学院细胞中心保存。DMEM培养基（美国Gibco公司），无支原体胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），RNA提取试剂盒Trizol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），PCR试剂盒（北京博迈德公司），pcMIRNA慢病毒表达质粒（美国SBI公司），转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）。1.1.2主要仪器PTC100型PCR仪由美国MJ Research股份有限公司

11、制造，DYCZ-26B电泳仪由北京沃德生物医学仪器公司制造，FACSAria流式细胞仪由美国BD公司制造。1.2 方法1.2.1细胞培养及外周血单个核细胞的获得 人慢性髓系白血病细胞系K562由本室保存，将细胞置于含10胎牛血清、1×105IUL青霉素及1×105IUL链霉素的DMEM培养液中，于37、5 CO2培养箱中常规培养。将所采集的新鲜正常人外周血以含2mmol/L EDTA的1×PBS按照1:4体积进行稀释，然后用滴管反复吹打混匀。在20×150mm灭菌试管底部加入4ml 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml)。将

12、稀释好的外周血用滴管轻轻铺于分离液上，20°C，400g水平离心3040min。小心地吸取中间相(含单个核细胞)到一个新的50ml离心管中。管中再加入含2 mM EDTA的1×PBS，吹打混匀，20 水平离心去除上清，收集细胞。1.2.2重组慢病毒颗粒的收获及感染K562细胞 于转染前一天进行293TN细胞铺板（10cm培养皿），密度大约为22.5×106 细胞/皿。脂质体法转染293TN细胞，首先将质粒2µg pMIRZip-21与SBI公司的20µl packaging mix，以及30µl lipofectamine plus混

13、合加入到400µl DMEM培养基中，室温孵育15min，同时，将20µl lipofectamine加入到400µl DMEM中。再将两者混合，室温孵育15min。用无血清培养基给细胞换液，随即将上述混合物缓慢加入到培养皿中，轻轻混匀。于转染后68h弃去旧的培养基，将细胞培养于10ml新鲜的完全培养液中。转染24h后，荧光显微镜下观察荧光，确定转染效率（转染效率为8590%）。转染48h后，收集上清。3000转/分离心5min，0.45µm微孔滤膜过滤，使用PEG-it试剂进行浓缩，离心收集沉淀，200-500µl PBS溶解，-70储存。

14、慢病毒的滴度测定：将293T细胞以3×104cells/ml的密度铺于24孔板中，每孔3×104个细胞。第二天细胞数应该达到68×104细胞/孔，于24孔板中加入梯度稀释的病毒液。第三天补充1ml的新鲜培养基。第四天通过荧光显微镜下观察或流式分析确定表达绿色荧光蛋白的细胞比例，并根据第二天的细胞数量计算病毒滴度（病毒滴度为15×106IU/ml）。 感染前一天，以适合密度传代K562细胞，使细胞在感染时处于对数生长期，将上述收获的慢病毒颗粒加入到完全培养基中，使用含慢病毒颗粒的培养基给细胞换液，并持续培养48-72h。1.2.3Northern blot

15、检测microRNA-21的表达 使用TRIzol（Invitrogen）提取细胞中的总RNA，具体操作按照TRIzol说明书进行。提取的总RNA测定浓度后，用于Northern blot 样品，在15%聚丙烯酰胺变性胶上进行分离。15%聚丙烯酰胺胶配方为：DEPC-ddH2O，2.0ml ；5×TBE，4.0 ml； 45Acr，6.66 ml； Urea，9.6g ；10AP，150.0l； TEMED，7.0-8.0l。电泳在1×TBE缓冲液中进行，18mA稳流，23h。0.5×TBE转膜缓冲液中进行转膜，将样品转移到N+尼龙膜上，200mA稳流，2h。转膜

16、结束后，紫外交联固定。杂交过程如下：在杂交液中37封闭2h，再加入同位素标记的DNA探针进行杂交。探针标记体系如下：探针，10. 0l；10×Buffer，5.0l；T4多核苷酸激酶1U；-32P ATP (10Ci/l)，5.0l；ddH2O，29.0l；37水浴，1h；杂交在37，过夜。洗膜过程先在漂洗液（1 × SSC， 1%SDS）中，室温，洗两遍，再在洗膜液（1 × SSC， 0.5%SDS）中，37，洗一遍，经放射自显影得到杂交结果。内参照基因U6 snRNA杂交前将膜在1%的SDS中煮沸5min后，于洗膜液（1 × SSC， 0.5%SDS

17、）中室温漂洗5min，后续步骤同上。1.2.4MTT法检测细胞增殖及细胞存活率将5×l03细胞接种于96孔板中，实验分3组：单独过表达microRNA-21组、单独伊马替尼组、联合作用组。预实验中microRNA-21抑制剂设5中不同浓度，分别为25、50、75、100、125nmol/L；伊马替尼设6种不同浓度浓度，分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mol/L，发现microRNA-21抑制剂100 nmol/L 、伊马替尼0.5mol/L浓度即具有明显抑制k562细胞生长作用，故实验中采用以上两种浓度。每组设3个复孔，取其平均值。培养l、2、3、4、5 d

18、后，分别计算细胞数，绘制细胞生长曲线及存活率。实验重复3次。1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 在不同时间点，收集细胞，用4预冷的磷酸缓冲液（PBS）洗2次，75%的预冷乙醇固定过夜，经RNA酶A（RNaseA）消化后，碘化丙锭（PI）染色30 min，应用流式细胞仪进行测定。1.2.6统计学分析 全部数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，两两比较采用Durmett t检验，p<0.05作为有显著意义。2 结果 2.1 microRNA-21在K562细胞中的表达情况检测K562细胞是CML来源的白血病细胞系，我们使用Northern blot方法检测了K562细胞中内源microRN

19、A-21的表达情况，并与正常人外周血来源的单个核细胞进行比较。结果显示，microRNA-21的表达水平在K562细胞中明显高于正常人（图1）。图1 Northern blot检测microRNA-21在K562细胞与正常人外周血单个核细胞相比的表达差异情况。K562，人慢性髓系白血病细胞系K562; N1-3，正常人外周血单个核细胞。Fig. 1 The comparison of expression level of micorRNA-21 in K562 cells and peripheral blood mononuclear cells from normals. K562, h

20、uman chronic myeloid leukemia cell line; N1-3, peripheral blood monocytes from normal controls. 2.2 抑制microRNA-21表达对K562的增殖和细胞周期运行的影响为了进一步检测microRNA-21在K562中的作用，我们在293TN细胞中包装并收获了能够抑制microRNA-21表达的重组慢病毒颗粒，感染K562细胞，经流式分选得到稳定细胞株后，Northern blot检测显示感染pMIRZip-miR-21的K562细胞株与感染pMIRZip的K562相比，microRNA-21的表达

21、水平明显降低（图2）。我们进一步检测了抑制microRNA-21表达对K562增殖和细胞周期的影响，如图3所示，microRNA-21表达受到抑制后，K562细胞的周期运行明显减慢，表现为G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例减少。图2 Northern blot检测microRNA-21的抑制情况中Fig. 2 Inhibition of microRNA-21detected by Northern blot.图3 microRNA-21表达抑制后K562细胞周期的变化Fig. 3 Cell cycle detection of K562 cells with inhibited mico

22、rRNA-21 expression.2.3 联合使用microRNA-21表达拮抗及伊马替尼对K562细胞增殖和周期的影响我们使用伊马替尼作用于感染了pMIRZip-21的K562细胞株后，其细胞生长速度与伊马替尼单独作用的K562细胞及单独感染pMIRZip-21的K562相比均降低，细胞存活率显著降低（图4）。同时，处于细胞周期G0/G1期的K562细胞比例也显著升高（图5）。图4 microRNA-21表达抑制与伊马替尼联合应用对K562细胞生长的影响Fig. 4 Cell growth detection of K562 cells with combination treatmen

23、t of micorRNA-21 inhibition and imatinib. *p<0.05; *p<0.01.图5 microRNA-21表达抑制与伊马替尼联合应用对K562细胞周期的影响Fig. 5 Cell cycle detection of K562 cells with combination treatment of micorRNA-21 inhibition and imatinib.3 讨论 慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种多能造血髓系前体细胞异常增殖所引发的恶性疾病，在我国发病率较高，约占成人白血病的15左

24、右。随着近几十年对其发生发展机制的深入研究发现，绝大多数的CML患者细胞中存在9号和22号染色体的易位：t(9；22) (q34；ql1)。该易位生成的Bcr-Abl融合蛋白具有异常激活的酪氨酸激酶活性，使细胞内多条增殖和抗凋亡相关的信号传导途径被异常激活，促进细胞在不依赖细胞因子的情况下过度增殖并发生恶性转化6。目前，一种针对该融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)应运而生，并广泛应用于临床治疗中7。但是由于伊马替尼针对的靶点比较单一，而且存在耐药复发问题，为了取得更好的临床治疗效果，伊马替尼已与其他抗肿瘤药物联合应用的研究已成为新的热点。 microRNA是一类在诸多生理和

25、病理过程中起重要调节作用的非编码RNA分子，尤其近年来，肿瘤相关的microRNA研究揭示出许多在肿瘤发生发展、诊断、以及预后等方面起重要作用的microRNA分子。MicroRNA-21就是其中一员，已有研究结果表明microRNA-21在包括CML的多种癌症中高表达，并且对肿瘤细胞的增殖和迁移起到明显的促进作用，提示拮抗microRNA-21的表达可能成为CML等肿瘤治疗的新靶点8,9。我们在CML来源的细胞系K562中实验了抑制microRNA-21对细胞生长和细胞周期的影响。结果显示，使用慢病毒介导的基因转移可以有效抑制K562细胞内源microRNA-21的表达，同时，microRN

26、A-21表达降低的同时使细胞周期的运行变缓，说明microRNA-21可以通过作用于细胞周期影响细胞的生长。进一步地，我们实验了联合应用microRNA-21拮抗与传统CML治疗药物伊马替尼对于K562的影响。同样地，在两种干预和联合作用下，K562细胞的周期进一步受到了抑制，并且细胞存活率与单独使用伊马替尼相比显著降低。由于microRNA作为药物治疗靶点具有先天优势，比如，现在已有试验证实使用体外合成的寡聚核苷酸microRNA抑制剂（antagomiR）通过静脉注射可有效抑制小鼠内源的microRNA表达10。结合我们的研究结果，提示microRNA-21作为潜在治疗靶点与伊马替尼联合使

27、用治疗CML的前景。参考文献：1 Iorio MV, Croce CM. MicroRNAs in cancer: small molecules with a huge impact J. J Clin Oncol, 2009, 27:5848-5856.2 Esquela-Kerscher A, Slack F. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer J. Nat Rev Cancer, 2006, 6: 259-269. 3 Hobert O. Gene regulation by transcription factors and microRNAs J. Science, 2008, 319:1785-1786. 4 Kota J, Chivukula RR, O'Donnell KA, et al. Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver canc