Neon细胞电转仪中文说明书

1、,简单的3步骤程序。1将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA , RNA , siRNA ）的混合物加入到提取物中。2. 将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中；在设备上选择程序，然后按开始。3拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器 中。注：1.为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液2. 为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次二，软件操作程序1按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon?设备。本 机检查确保Neon?移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。2.按

2、Voltage启动数字键盘输入电压值。 按所需的电压值，然后 按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制， 则会显示 错误信息，并自动设置最小的限制值。3按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。4. 按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。5. 如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。6. 按所需的程序编辑程序。选定的程序会突出显示。7. 显示“ Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。 光标自动移动 到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage, Width 和P

3、ulses信息。&按Enter键将信息保存在数据库中。9.继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座三，细胞与DNA混合物准备注意事项：1. 将纯化的DNA重悬于1-5卩gg L浓度的去离子水或 TE缓冲 液(10mM TrisHCI , 1mM EDTA , pH8.0)中。浓度可能因细胞 类型而异。2. DNA量不应超过使用总体积的10%。3. 通过测量A 260/280比例来检查纯化的 DNA制剂的纯度。电穿孔的比例应至少为1.8。4. 该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。使用大于20 kb的质粒很可能降低转染效率。5. 不要用乙醇沉淀

4、DNA以浓缩DNA。通过乙醇沉淀的浓缩 DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。6. 不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）流程:1. 用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液 E, 10卩LNeon?Tip和BufferE2, 100卩LNeon?Tip ）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸 入缓冲液中。）2.将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声确保Neon?管的侧面电极与 Neon?移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）3. 在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为 70-90 %汇合。4. 对于大多

5、数优化协议，每 10卩LNeon?Tip可提供5X 104-2X 105个细胞。（5X 105-2X 106个细胞每100卩LNeon?Tip适用于大 多数优化的方案。）5将含有血清，PBS （不含Ca2 +和Mg2 + ）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养基的等分试样预温至 37C。从培养瓶中吸出培养基， 并使用PBS （不含Ca2 +和Mg2 + ）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLE Express （目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶 消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞 密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在 室温下以100-40

6、0 X g离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400X g离心5分钟，用PBS （不含Ca2 +和Mg2 + ）清洗细胞。吸 出PBS并以1.0X 10 7个细胞/ mL的最终密度将细胞沉淀重悬于Resuspension Buffer R中。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。 可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。6. 通过用含有血清和补充剂的 0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37C / 5% CO 2培养箱中预培养板。 如 果您使用其他培养板

7、，请参见第18页电镀介质卷建议。7. 对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液FormatCell TypeDNA (pglsiRNA (nM)Necn ttTipVoL plating mediumCell no.Buffer R orBuffer T*96-wellAdherent10-20010|jLlOOpL1-2 - 1(T10 pL/weLLSuspensiion0 5-1IOjjLD2-5x10*IO iL/wellAdherentD.25-110-200IOjL25D pL2.5-5 n 1

8、0*10 pL/weUSuspension0.5-2IOjjLO5-12.5 « 10*10 pLyweLL24-weLlAdherent0.5-210-200IQpLD500 卜1_0.5-1 x 10510 pL/weUSuspension0.5-310|jL1-2.5x 10s10 pL/weLL12-weLlAdherent0.5-310-20DIOjjL1 mLT x 1210 iL/wellSuspension0.5-3IDpL2-5 x 10s10 pL/wetlAdherent0 5-3 no pu 5-30 (100 pL越山叫L2-A k 10s10 pL cr1

9、00 pL/weUA-WflU10-2002mLSuspension0 5-3 IOjjLI 5-30 (100 pLIDpL/IOOpL0.4-1 x ID*10 pL or100 pL/welll60 mmAdherent5-3010-2D00)0 pL5 mL0 5-1 «1IT100L/weLlSuspension5-3000 pL1-2.5 nIO1100 pUweLL10 cmAdherentS-3010-20000 pL10 mL1-2x10*100 iL/weltSuspension5-30IQJQ pL2-5 “ IO4IQOpL/weU8. 使用3 mL电解缓冲液

10、（使用缓冲液 E, 10卩LNeon?Tip和缓冲液E2, 100卩LNeon?Tip ）装入Neon?移液管9. 根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件10. 将适量的质粒 DNA / siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。11将细胞加入到含有质粒 DNA / siRNA的管中，轻轻混合。 请 参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。12.要将Neon?Tip插入Neon?移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具13将Neon?移液器的顶部插入 Neon?Tip，直到夹具完全拿起 活塞的安装杆（见下图）14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在

11、移液管上，没有间隙。注意：确保Neon?移液器和尖端紧 密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接15将Neon?移液器上的按钮按到第一站，并将Neon?Tip浸入细胞DNA / siRNA混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA / siRNA 混合物吸入 Neon?Tip。在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧， 导致转染降低或失败。 如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品， 并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。air bubbles16.将带有样品的Neon?移液器垂直插入放置在 Neon?移液器站 中的Neon?Tube，直至听到咔嗒声。确保移液器突起

12、插入吸液管的槽中。17.确保Neon?移液器的金属头与Neon?移液器支架的球形活塞 和Neon?Tube （见左图所示的正确位置）紧密连接。O|Li_ i18.在传送电脉冲之前，Neon?TubeNeon?Pipette是否正确插入。19. 在电穿孔期间监测 Neon?Tip，以查看是否有由于尖端存在气 泡引起的电弧（火花）。电弧导致转染效率低，细胞活力低。20. 交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete ”以指示电穿孔完成。21. 从Neon?移液器站慢慢移除Neon?移液器，并 立即从Neon?Tip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预 热培养基的准备培养基中。22. 我

13、们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。23. 要放弃Neon?Tip，请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危 险废物容器。24. 对剩余的样品重复步骤7-16。使用两次后，请务必更换Neon?Tips，并在10次使用后更换 Neon?Tubes。每个新的质粒DNA样品使用新的 Neon?Tip和Neon?Tube25. 轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。在37C下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。1. 如果您没有使用 Neon?设备，将后面的电源开关转到OFF位2. 避免在Neon?移液器台溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹3. 如果您不

14、小心将任何液体 （如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon? 移液器站，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。 倒置并允许车站在室温下完全干燥 24小时。优化流程AdherentSusponslcnResuspension Buffer RExamples include:3T34 HEK293,COS-7, C2C12,Hold, HCP15,PC-12, MDCKRSW264.7, U-2OSExamples Inducie: HL-eo, K-562, Jurkat LOL, R&mcs, U-937r工|AdherentLJSuspension1 1Rflsuspension

15、 BufwRRDSuapenalon ? BuiforTr、ExHjnploa include: Neuronal r Stem, Hepatocyte HUVEG Macnophagor D-andrftiefrExamples Include： T«llst 21 氐 NKoe4l&f PBMC. Monocytes1. 确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用 DNA或siRNA , 并制备含有0.5 mL含有血清和无抗生素的培养基的 24孔板，以 转移电穿孔细胞。 准备足够的细胞和质粒 DNA / siRNA进行至 少30次转染。2. 对于使用24孔格式的10卩LN

16、eon?Tip的每个电穿孔样品，请 参见下表。 对于以24孔格式使用100卩LNeon?Tip，请将下表 中列出的数值适当调整10倍。C«Ll typeCHI no.DNAsiRNABuffer RAdherent1 x lOVweLl0.5 pg DNA/wc IL15 pg/plare50 pmo. ii 10pL tip100 nM per weLL10 pL/wt?l(2S5 pL/pl白述Suspension2 - l07«ell1 卩耳NA/wpII30 pg/phte1 CO pmal in If! pL tip 20U nM per well10p_/jue

17、ll270 pL/pktc3. 使用3 mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10卩LNeon?Tip和缓 冲液E2, 100卩LNeon?Tip ）置于含有细胞 DNA / siRNA混合物的Neon?移液站中，如第15页所述。4. 按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。5ampl&W 也1 oa.Pulse voltagePulse widthPulseno.ResultsTransfection efficiencyC电IL viability1Alprs-opiinnized parampt&r or control wiKhout electroporation.214002013A31500201占JU160015A517002Q16A611003017311200301E21300301¥83UOO30110B410U040111B511OOiQ11236120040113Cl11OO202UC212C020215C313002021&am