酶的生物合成法生产1

1、第二章第二章 酶的生物合成与发酵生产酶的生物合成与发酵生产 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成法生物合成法 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶 第一节第一节 酶生物合成及调节酶生物合成及调节一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则转转录录传传递递给给RNA，再再由由RNA 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA 核酸是生物遗传的物质基础核酸是生物遗传的物质基础, ,蛋白质是生命活动的体现者蛋白质是生命活动的体现者.

2、 .DNA 子代子代DNA 信使信使RNA 蛋白质蛋白质 复制复制 转录转录 翻译翻译密码密码蛋白质生物合成依赖核酸正常功能蛋白质生物合成依赖核酸正常功能, ,核酸生核酸生物合成及基因表达的调节需要蛋白质参与物合成及基因表达的调节需要蛋白质参与. .（一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription)(transcription)定义定义: :以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNARNA聚聚 合酶（转录酶）的作用下，生成合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分子的过程。分子的过程。遗传信息遗传信息: :DNADNA片

3、段中的核苷酸排列顺序片段中的核苷酸排列顺序. .分类分类 : : mRNA tRNA rRNAmRNA tRNA rRNA特点特点: :以以DNADNA双链中的一条链的某个片段为模板双链中的一条链的某个片段为模板. .有意义链有意义链: :有指导转录作用的一条有指导转录作用的一条DNADNA链链. .反意义链反意义链: :无转录功能的一条无转录功能的一条DNADNA链链. .转录模板转录模板启动子（启动子（promoter) 终止子终止子(terminator)模板链（模板链（templatte strand） 反意义链反意义链(antisense strand)有意义链有意义链(sense

4、strand)非信息区非信息区5 5 3 3 T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶反意义链反意义链有意义链有意义链RNAPPi5555553333GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成33RNA的转录过程的转录过程( (三步三步) )1.1.起始起始2.2.延长延长3.3.终止终止 转录合成的转录合成的RNARNA是是rRNArRNA、tRNAtRNA、mRNAmRNA的前体的前体, ,还需经过加工修饰后才具有生物学功能还需经过加工修饰后才具有生物学功能. . 原核生物的原

5、核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP)E. coliE. coli的的RNARNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（ 2 2 ）核心酶（core enzyme）全酶（holoenzyme）起始因子RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子（启动子（promoter) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开The basic principle of transcript

6、ionRNA链的延伸图解链的延伸图解3 5 RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位翻译翻译: :以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。链的过程。mRNA蛋白质蛋白质翻译翻译 各种信息各种信息 各种蛋白质各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译

7、翻译(translation) (translation) mRNA 是带有是带有DNADNA遗传信息指导蛋白质合成的直接遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。模板。 氨基酸密码氨基酸密码 mRNAmRNA分子中分子中, ,每三个相邻的核苷酸组成的三联每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息体代表某种氨基酸或其它信息, ,称为称为密码子（密码子（codoncodon）或或三联体密码三联体密码。 四种核苷酸编成三联体可形成四种核苷酸编成三联体可形成4 43 3个即个即6464个密个密码子码子. .其中其中: :1.1.一个起始密码一个起始密码: :AUGAUG 位于位于mRNAmRNA

8、的的55末端末端, ,并兼作蛋氨酸的密码并兼作蛋氨酸的密码. . 2.2.三个终止密码三个终止密码: :UAA UGA UAGUAA UGA UAG 位于位于mRNAmRNA的的33末端末端3.3.多数氨基酸拥有多数氨基酸拥有2-42-4个密码个密码. . tRNA tRNAtRNA是氨基酸的转运工具是氨基酸的转运工具, ,能携带活能携带活化的氨基酸到核蛋白体。化的氨基酸到核蛋白体。 tRNAtRNA有特异性有特异性, ,至少有至少有2020种以上。每种以上。每种种tRNAtRNA的反密码环顶端均有由三个核苷的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码酸组成的反密码, ,能与能与mRNAmRNA

9、上相应的密码上相应的密码互补结合互补结合( (碱基互补配对碱基互补配对) )。 酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰- tRNA反密码反密码mRNA密码与反密码的碱基配对密码与反密码的碱基配对 rRNA rRNA rRNA与蛋白质组成核蛋白体与蛋白质组成核蛋白体, ,是蛋白是蛋白质合成的场所质合成的场所. .由大小两个亚基组成由大小两个亚基组成: :小亚基小亚基: :与与mRNAmRNA结合结合, ,沿沿5 35 3 方向移动方向移动. .大亚基大亚基: :受位受位(A(A位位):):结合氨基酰结合氨基酰- tRNA- tRNA给位给位(P(P位位):):成肽成肽AUG A

10、CA55蛋蛋苏苏UGUGUU33受受 位位(A位位)给给 位位(P位位)大亚基大亚基小亚基小亚基 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽链合成的起始肽链合成的起始v 肽链的延伸肽链的延伸v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运反应式：反应式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的第一而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰

11、甲硫氨酸（个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。核蛋白体循环（三阶段）核蛋白体循环（三阶段）1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段1.1.mRNAmRNA与小亚基结合：与小亚基结合：形成形成30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3复合物复合物2.2.AUGAUG与蛋氨酰与蛋氨酰- -tRNAtRNA结合：结合： 30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IFfMet-tRNA-IF2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAm

12、RNA的起始密码子上（的起始密码子上（AUGAUG）。）。3.3.大小亚基结合大小亚基结合IF130S30S起始复合物起始复合物AUG ACA5533AUG ACA5533UACUACAUG ACA5533小亚基小亚基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亚基大亚基GDP+Pi受位受位给位给位蛋蛋蛋蛋肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段肽链合成的延伸阶段肽链合成的延伸阶段1.1.进位进位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入受位进入受位; ;2.2.转肽转肽: :形成肽键形成肽键, ,在转肽酶作用下在转肽酶作用下, ,给位与给位与 受位结合受位结合; ;3.3.移位移位: :核蛋白体向核蛋

13、白体向33端移动一个密码子的端移动一个密码子的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不断地进位、转肽、不断地进位、转肽、 移位移位, ,使肽链延长。使肽链延长。AUG ACA5533UAC蛋蛋苏苏UGUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55蛋蛋苏苏UGUGUU333333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始复合体起始复合体进位进位转肽转肽移位移位Mg+K+肽链合成的终止阶段肽链合成的终止阶段1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合; ;2.2.肽键水解肽键水解, ,多肽释放多肽释放; ;3.3.t

14、RNA,mRNAtRNA,mRNA, ,大小亚基解离大小亚基解离. . AUG UAA55UACAUG UAA55UAC3333终终终终AUG UAA55UAC33终终5533UAC终终肽链肽链 肽链中氨基酸残基的化学修饰肽链中氨基酸残基的化学修饰 乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化切除前体中功能不必需肽段切除前体中功能不必需肽段 肽链的折叠肽链的折叠二硫键的形成二硫键的形成二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节 转录水平的调节是酶生物合成中最重要转录水平的调节是酶生物合成中最重要的调节，的调节，是一种在基因水平上的代谢调节。是一种在基因水平上的代谢调节。与调节酶活

15、性的反馈抑制相比，调节酶的合与调节酶活性的反馈抑制相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。类较间接而缓慢的调节方式。定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。转录水平上进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。生物合成的原料和能量。 操纵子基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质, strutural gene, S）控制部位操纵基因（operator gen

16、e, O）启动子（promotor gene, P）Jacob and Monod的的诱导型操纵子：只有当存在诱导物时，转录频率才最高乳糖操纵子阻遏型操纵子 : 只有当缺乏辅阻遏物时,转录频率才最高 色氨酸操纵子基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子 调节基因调节基因(regulator gene)(regulator gene)： 可

17、产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein)(regulatory protein) （一种（一种变构蛋白变构蛋白），通过与效应物通过与效应物(effector) (effector) （包括诱导物和（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。RPOSD N AC RP-cA M P复 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP复合物的作用示意图 启动基因（启动基因（promoter gen

18、epromoter gene）（启动子）：）（启动子）： 有两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又称环腺苷酸受体蛋白），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP (cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-C

19、RP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。 操纵基因（操纵基因（Operater geneOperater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（结构基因（Strutural geneStrutural gene）: : 决定某一多肽的决定某一多肽的DNADN

20、A模板，与酶有各自模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。( (二二) ) 酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induction)(induction) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。物而临时合成的一类酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repression) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)(cata

21、bolite repression) 反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)(feedback repression) 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，）大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三细

22、胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；种酶基本消失； （3）表明菌体生物合成的经济原则：）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。乳乳糖糖操操纵纵子子的的负负调调控控调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结

23、构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）诱导诱导 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸

24、的存在阻止了色氨酸合成酶的）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则合成，体现了菌生长的经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基基因不能表达因不能表达酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模

25、模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以

26、表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻

27、源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才

28、开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二二次生长现象次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 细胞 浓 度(OD)时 间(h) 这一现象又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）, ,亦称亦称降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPC

29、AP）。）。乳糖操纵子的正调控乳糖操纵子的正调控分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状

30、态呈失活状态三、提高酶产量的策略三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸） 1.1.诱变育种诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型（消除对诱导剂的依赖）使诱导型变为组成型（消除对诱导剂的依赖） 选育组成型突变株选育组成型突变株(2) (2) 使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2. 基因工程育种基因工程育种 （二）条件控制（二）条件控制1. 1. 添加诱导物添加诱

31、导物 酶的作用底物（或底物前体）酶的作用底物（或底物前体） 诱导物分三类诱导物分三类 酶的反应产物酶的反应产物 酶的底物类似物（最有效）酶的底物类似物（最有效）2. 2. 降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富避免培养基过于丰富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP3.3.促进分泌（添加表面活性剂）促进分泌（添加表面活性剂） 离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用表面活性剂表面活性剂 TweenTween8080 非离子型非离子

32、型 增加细胞通透性增加细胞通透性 TritonXTritonX1001004. 4. 添加产酶促进剂添加产酶促进剂 产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度。浓度。 第二节第二节 酶发酵动力学酶发酵动力学 n研究内容：研究内容：研究发酵过程中细胞的生长速研究发酵过程中细胞的生长速率，产物的形成速率以及环境因素对这些率，产物的形成速率以及环境因素对这些速率的影响。即研究速率的影响。即研究生物反应速度的规律。生物反应速度的规律。n意义：意义：更加深入地认识和掌

33、握发酵过程，更加深入地认识和掌握发酵过程，为工业发酵的模拟、优化和控制打下基础。为工业发酵的模拟、优化和控制打下基础。n研究方法：研究方法：用数学模型定量描述。用数学模型定量描述。一、细胞生长动力学一、细胞生长动力学内容：内容：研究细胞生长速率及外界环境研究细胞生长速率及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。因素对细胞生长速率影响的规律。目的：目的：使细胞生长速度维持在一定范使细胞生长速度维持在一定范围内，以达到较为理想的效果。围内，以达到较为理想的效果。 EDCBAO细 胞浓度 (g/L)培养时间 (h ) 细胞生长曲线细胞生长曲线 O-A 延迟期延迟期 A-B指数生长期指数生长期 B-C减

34、速期减速期 C-D 静止期静止期 D-E 衰亡期衰亡期 在分批培养在分批培养(batch culture)(batch culture)过程中，细胞生长过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期衰亡期5 5个阶段。个阶段。 营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：之间的动力学关系：MonodMonod模型模型n:比生长速率（比生长速率（1/h） （specific growth rate）即每）即每单位数量的细菌或物质在单位时间内（单位数量的细菌或物质在单位时间内（

35、h）增加的量）增加的量nmax：最大比生长速率（：最大比生长速率（1/h）nS：营养物浓度（生长限制基质浓度）：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克克/LnKs：莫诺德常数或莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数饱和常数或营养物利用常数 克克/L，或或 mol/LSKSXdtdXsm1nKs是使是使达到最大比生长率达到最大比生长率max值一半时的值一半时的营养物浓度（限制基质浓度）。营养物浓度（限制基质浓度）。n当一种限制性营养物浓度当一种限制性营养物浓度S大大低于大大低于Ks时，时，=maxS/Ks，即，即很小，此时生长很慢。很小，此时生长很慢。n当当S=Ks时，时，=0.5 max，随营养物浓

36、度增加，随营养物浓度增加，相应增加，逐渐趋向相应增加，逐渐趋向max，成为营养物浓成为营养物浓度的重要函数，此时营养物浓度仍是生长的度的重要函数，此时营养物浓度仍是生长的限制因素，在限制因素，在Monod模型上表现为曲线。模型上表现为曲线。n当当S无限大时，无限大时，max，理论上最大潜力。，理论上最大潜力。n当营养物浓度当营养物浓度S大大高于大大高于Ks时，营养物浓度时，营养物浓度不再影响微生物生长，即不再影响微生物生长，即S的变化不再成为的变化不再成为生长限制因素，此时，生长限制因素，此时，接近接近max，在，在Monod曲线上表现为直线。曲线上表现为直线。n在分批培养时，在分批培养时，K

37、s表示微生物对营养物的亲表示微生物对营养物的亲和力，和力，Ks越小，微生物对限制性营养物的亲越小，微生物对限制性营养物的亲和力越大，限制性营养物的浓度必须降低到和力越大，限制性营养物的浓度必须降低到十分低的水平，才能影响微生物的生长，十分低的水平，才能影响微生物的生长，Ks越大，亲和力越小，即使限制性营养物浓度越大，亲和力越小，即使限制性营养物浓度很高，生长率也下降。很高，生长率也下降。n 一些微生物的一些微生物的max和和Monod饱和常数饱和常数n微生物微生物 生长限制基质生长限制基质 max KsnE. Coli 葡萄糖葡萄糖 0.85 2.0-4.0nE. Coli 乳糖乳糖 20n酿

38、酒酵母酿酒酵母 葡萄糖葡萄糖 0.13 25n木霉菌木霉菌 葡萄糖葡萄糖 0.13 43.2n产脘假丝酵母产脘假丝酵母 氧氧 0.44 0.03n产脘假丝酵母产脘假丝酵母 甘油甘油 4.5 二、产酶动力学二、产酶动力学 （一）（一） 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为的生物合成分为3 3种模式，即：种模式，即： 同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型 延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型1. 1. 生长偶联型（又称

39、同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型） 酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的成立即停止，表明这类酶所对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。a 酶细 胞细胞 或酶浓 度时间生长偶联型中的特殊形式生长偶联型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的

40、合成也随着停止胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA是不稳定的。是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5 细胞 浓 度 酶浓 度细胞 浓 度 (OD500)酶浓 度(U/mL)时 间 (h)2.2.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型） 酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：

41、可受诱导，一般不受分解代谢物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物阻遏。 所对应的所对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。b酶细 胞 细胞 或酶浓 度时间3. 3. 非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型） 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这易类型并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这易类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。c酶细 胞细胞 或酶浓 度时间总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停

42、止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。 受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，

43、如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。( (二二) ) 产酶动力学产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：一般产酶动力学方程可表达为：XdtdE式中式中 XX细胞浓度细胞浓度(g /L)(g /L) 细胞比生长速率细胞比生长速率(h(h-1-1) ) 生长偶联的比产酶系数生长偶联的比产酶系数(IU/g)(IU/g) 非生长偶联的比产酶速率非生长偶联

44、的比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h) E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L) t t时间时间(h)(h)生长偶联型生长偶联型XdtdE部分生长偶联型部分生长偶联型 XXdtdE非生长偶联型非生长偶联型 XdtdE 第三节第三节 微生物发酵产酶微生物发酵产酶概念：概念：利用微生物的生命活动获得所需酶的技利用微生物的生命活动获得所需酶的技术过程。术过程。现状：现状：大多数酶采用微生物细胞进行发酵生产。大多数酶采用微生物细胞进行发酵生产。原因：原因：微生物研究历史长，且具有种类多、易微生物研究历史长，且具有种类多、易培养、代谢能力强等特点。培养、代谢能力强等特点。 已发现的酶近已发现的

45、酶近30003000种种 应用于工业、医药、遗传工程、分析研究领应用于工业、医药、遗传工程、分析研究领域的酶有域的酶有25002500种种 工业生产商品酶工业生产商品酶50-6050-60种种 大规模工业生产的有大规模工业生产的有1010多种多种 研究用商品酶研究用商品酶300-400300-400种种一、一、 产酶微生物的分离和选育产酶微生物的分离和选育1. 1. 产酶菌种应具备的条件（优良产酶菌产酶菌种应具备的条件（优良产酶菌种的标准）种的标准）（1 1）酶产量高）酶产量高（2 2）易培养（生长速率高、营养要求低）易培养（生长速率高、营养要求低）（3 3）遗传性能稳定，不易退化）遗传性能稳

46、定，不易退化（4 4）易分离提纯）易分离提纯（5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌）2.2.常用的产酶微生物常用的产酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida3.3.微生物发酵产酶方法微生物发酵产酶方法固体培

47、养固体培养: :特别适合于霉菌培养特别适合于霉菌培养 液体培养液体培养: :目前酶发酵生产的主要方式目前酶发酵生产的主要方式 固定化细胞固定化细胞 : :需要特殊的固定化细胞反应器需要特殊的固定化细胞反应器 细菌细菌 - -淀粉酶的生产（液体深层发酵）淀粉酶的生产（液体深层发酵） 工艺流程：工艺流程：斜面菌种斜面菌种孢子悬液孢子悬液种子扩大培种子扩大培养养罐发酵罐发酵热处理热处理盐析盐析压滤压滤干燥干燥粉粉碎碎成品成品 霉菌霉菌 - -淀粉酶的生产（固体曲）淀粉酶的生产（固体曲） 工艺流程：工艺流程：斜面菌种斜面菌种三角瓶菌种三角瓶菌种种曲种曲厚厚层通风培养层通风培养粉碎粉碎抽提抽提过滤过滤沉

48、淀沉淀压滤压滤烘干等烘干等4.4.微生物酶的类型微生物酶的类型（1 1）胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、）胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。（2 2）胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的）胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。 5. 5. 产酶

49、微生物的分离和筛选产酶微生物的分离和筛选 1)1)样品的采集样品的采集 2)2)富集培养富集培养 添加特殊的营养物质添加特殊的营养物质 调整培养基的酸碱性调整培养基的酸碱性 控制培养温度和热处理控制培养温度和热处理 添加抑制剂添加抑制剂 3)3)分离获得微生物的纯培养（分离获得微生物的纯培养（pure culturepure culture） 4)4)初筛初筛 选出产酶菌种，以多为主选出产酶菌种，以多为主 5)5)复筛复筛 选出产酶水平相对较高的菌株选出产酶水平相对较高的菌株 ，以质为主。，以质为主。 酶活测定方法的建立尤其重要。酶活测定方法的建立尤其重要。 - -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选蛋白

50、酶产生菌的获得方法蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基应用含酪蛋白的培养基6.6.产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种诱变育种 原生质体融合育种原生质体融合育种 基因工程育种基因工程育种 试管菌种培养茄瓶菌种培养摇瓶菌种培养孢子（菌体）悬液制备种子罐菌种培养发酵罐发酵发酵液预处理酶的分离纯化精制酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程 三、发酵工艺条件及其控制三、发酵工艺条件及其控制 1.1.细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养 2.2.培养基的配制培养基的配制 3.pH3.pH值的调节控制值的调节控制 4.4.温度的调节控制温度的调节控制 5.5.溶解氧的

51、调节控制溶解氧的调节控制 在影响的诸多因素中，营养条件最为重要在影响的诸多因素中，营养条件最为重要 1 1）营养物种类：）营养物种类： 要考虑碳源对酶生物合成的调节作用，如产要考虑碳源对酶生物合成的调节作用，如产生诱导作用还是分解代谢物阻遏作用。生诱导作用还是分解代谢物阻遏作用。 2 2）营养物比例：）营养物比例： C/N C/N比不当比不当, , 影响菌体对按比例吸收营养物影响菌体对按比例吸收营养物 改变原来合适的改变原来合适的pHpH环境环境 氮源不足，表现为菌体繁殖慢，氮源不足，表现为菌体繁殖慢， 碳源不足，表现为菌体容易衰老碳源不足，表现为菌体容易衰老3 3）营养物浓度：）营养物浓度：

52、对易被吸收的限制性营养物浓度控对易被吸收的限制性营养物浓度控制为充足而不过大。制为充足而不过大。第四节第四节 动、植物细胞培养产酶动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。需采用各自不同的培养工艺。 动物细胞模式图植物细胞结构 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复

53、杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数敏感大多数敏感敏感敏感主要产物主要产物色素、药物、香色素、药物、香精、酶等精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激素、单疫苗、激素、单克隆抗体、酶等克隆抗体、酶等三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢

54、物的生产要求一定的植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞、微生物和动物细胞的主要目的产物各不植物细胞、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。相同。一、植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶 1.1.植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点 以往提取法的缺点：以往提取法的缺点： 提取工艺复杂；提取工艺复杂； 植物的栽培和生长受地理环境和气候条植物的栽培和生长受地理环境和气候条件的影响；件的影响； 易破坏野生植物资源，影响生态环境。易破坏野生植物资源，影响生态环境。 利用植物细胞发酵产酶的优点：利用植物细胞发酵产

55、酶的优点： 提高产率、缩短周期。提高产率、缩短周期。 易于管理，减轻劳动强度。易于管理，减轻劳动强度。 提高产品质量。提高产品质量。 2.2.培养基培养基 植物细胞培养基与微生物培养基的不同点在于：植物细胞培养基与微生物培养基的不同点在于：（1 1）植物细胞的生长代谢需要大量的无机盐。）植物细胞的生长代谢需要大量的无机盐。包括包括N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等等6 6种大量元素，种大量元素，FeFe、B B、MnMn、CuCu、ZnZn、MoMo、ClCl等等7 7种微量元素。种微量元素。 （2 2）植物细胞需要多种维生素和植物生长素，）植物细胞需要多种维生素和植物生长素

56、，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。素等。（3 3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源。）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源。（4 4）植物细胞一般以蔗糖为碳源。）植物细胞一般以蔗糖为碳源。应用最广的是应用最广的是MSMS培养基和培养基和LSLS培养基培养基 MSMS培养基是培养基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog为烟草细胞培养而设计的培养基。为烟草细胞培养而设计的培养基。LSLS培养基培养基是在其基础上演变而来的。是在其基础上演变而来的。组分MS培养基（ml/L）碳源大量元素微量元素铁

57、盐维生素pH值蔗糖30 g/LMS1 100MS2 10MFe液 10MB液105.7MS培养基组成3.3.培养方法培养方法 植物细胞的大规模培养方式为悬浮细胞培养。植物细胞的大规模培养方式为悬浮细胞培养。与微生物发酵一样，包括三个步骤：与微生物发酵一样，包括三个步骤：细胞株的建立，包括外植体的选择与处理，愈细胞株的建立，包括外植体的选择与处理，愈伤组织的培养，愈伤组织经单细胞分离出的优良伤组织的培养，愈伤组织经单细胞分离出的优良无性繁殖系，经摇瓶培养所得的游离细胞，供作无性繁殖系，经摇瓶培养所得的游离细胞，供作种子；种子；扩大培养；扩大培养；大罐培养；有分批培养法、半连续培养法和连大罐培养；

58、有分批培养法、半连续培养法和连续培养法。续培养法。外植体：外植体： 外植体是从植株取出，经过预处理后，用外植体是从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：愈伤组织： 将上述植外体植入诱导培养基中，于将上述植外体植入诱导培养基中，于2525左右，培养一段时间，即从外植体的切口部位左右，培养一段时间，即从外植体的切口部位长出小细胞团，此细胞团称为愈伤组织。长出小细胞团，此细胞团称为愈伤组织。水稻的外植体（幼水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织胚）和愈伤组

59、织外植体外植体愈伤组织愈伤组织4. 4. 培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制（1 1）温度：一般控制在室温范围（）温度：一般控制在室温范围（2525左右）。左右）。（2 2）pHpH：一般控制在微酸性范围，即：一般控制在微酸性范围，即pH5pH56 6。（3 3）通气与搅拌：适当。）通气与搅拌：适当。（4 4）光照的控制：对光照强度、时间、波长有）光照的控制：对光照强度、时间、波长有 一定的要求。一定的要求。（5 5）前体的添加（饲喂）：增加次级代谢产物）前体的添加（饲喂）：增加次级代谢产物 的产率。的产率。（6 6）诱导子（）诱导子（elicitorselicitors）的应用：强化次

60、级代）的应用：强化次级代 谢物的生物合成。谢物的生物合成。5.5.植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在在4 4冰箱中放冰箱中放3 3周，以打破休眠。去除外皮，周，以打破休眠。去除外皮，先用先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然后无菌水漂洗然后无菌水漂洗3 3次。次。 在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成