酶解大豆蛋白生产生物活性肽

1、酶解大豆蛋白生产生物活性肽游子娟 2013.3.18酶的选择 动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等； 植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等； 微生物来源蛋白酶，如丹麦 Novo 公司生产的碱性蛋白酶 Alcalase、复合蛋白酶 Protamex、中性蛋白酶 Neutrase 以及国产的碱性蛋白酶地衣型芽抱杆菌2709、中性蛋白酶枯草杆菌 1.398、放线菌 l66、栖土曲霉 3.942、酸性蛋白酶黑曲霉 3350等。一些蛋白酶的切割位点和较适 pH 值大豆肽的性质与功能 （l）易消化、易吸收性 （2）低抗原性 低分子肽具有低的抗原性，不会引起过敏反应，可为食物过敏

2、患者食用。（3）降胆固醇作用 大豆肽能刺激甲状腺激素分泌，促使胆固醇代谢生成胆汁酸，胆汁酸又被食物纤维素所吸附排出体外，从而阻碍对胆固醇吸收，起到降低胆固醇的作用。（4）降血压作用（5）减肥作用（6）抗疲劳、增强体力（7）抗氧化活性蛋白酶活力的测定方法 酶活力的定义为：1g 固体酶粉（或 1mL 液体酶），在一定温度和 pH 条件下，lmin内水解标准酪蛋白产生 1g 酪氨酸，即为 1 个酶活力单位，以 U/g（U/mL）表示。 酶活测定方法为福林酚法。其原理为蛋白酶在一定的温度与 pH 条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝

3、与钨蓝，用分光光度计于波长 680nm 下测定溶液的吸光度。因酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品的酶活力。水解度的测定方法 大豆蛋白水解度（DH）是水解过程中所断裂的肽键数占总肽键数的比例，通常表示为百分数的形式。肽键断裂后生成多肽或氨基酸，-氨基氮含量增加，因此，水解度可根据水解过程中生成的 -氨基氮的数量得到按下式进行计算： DH（%）（水解后生成的 -氨基氮的量/样品总含氮量）100% 水解后生成的 -氨基氮的量由甲醛滴定法测得，样品总含氮量由凯氏定氮法测得 苦味评价方法 称取奎啉 0.1g 溶于 50ml 5%乙醇溶液中，从中取 5ml 溶液用蒸馏水稀释到100ml，得到 1.0

4、10-4奎啉溶液，再进一步稀释成 510-5、2.510-5、110-5、510-6等浓度奎啉溶液，其苦味值分别定为 10、5、2.5、1、0.5,将制得的大豆多肽与不同浓度奎啉溶液比较，从而确定大豆多肽的苦味值。大豆肽抗氧化性的研究 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，这类活性肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效。从而能在一定程度上消除机体内多种生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生。 生物抗氧化剂通常通过以下五种途径来达到抗氧化目的：（1）抑制脂质过氧化反应。（2）直接清除活性氧自由基。（3）清除氧。（4）螯合金属离子。（5）激活机体本

5、身内在抗氧化防御系统。五种途径实际上都是围绕阻断脂质过氧化链式反应来进行。由于过量自由基容易引发机体内脂质过氧化链式反应，而机体内脂质过氧化是导致组织损伤的主要原因，所以研究抗氧化剂防止体内脂质过氧化的能力就显得特别重要.研究方法 1.采用亚油酸硫氰酸钾体系、邻苯三酚自氧化体系研究蛋白酶种类、水解方法、水解时间、水解度对水解物抗氧化活性的影响，确定获得高抗氧化性水解物的方法。 2.采用 Sephadex G25 凝胶过滤层析将大豆分离蛋白的水解物按分子量大小分成不同部分，采用亚油酸硫氰酸钾体系、邻苯三酚自氧化体系和人红细胞氧化溶血实验来研究水解液不同部分对抗氧化活性的影响。确定抗氧化性最高的大

6、豆肽的分子量范围。 3采用高效凝胶过滤色谱对抗氧化活性较好的大豆肽段继续进行分离，进一步确定抗氧化大豆肽的分子量分布范围。亚油酸硫氰酸钾方法 原理：通过链式反应积累起来的大量过氧化脂质将 Fe2+氧化生成Fe3+，Fe3+和 SCN-结合，生成红色硫氰酸铁。大豆肽由于能够清除自由基，从而阻断或抑制链式反应，减少红色硫氰酸铁产生。因此通过比色反应可以检测大豆肽抗氧化性的强弱。 在 5ml 具塞玻璃试管加入 1.5ml.0.15mol/L（pH7）的磷酸盐缓冲液，加入浓度 2待测大豆蛋白水解物样品 100L，加入 100l 50mmol/L 亚油酸的乙醇溶液和 25l 50mmol/L 的 FeC

7、l2-EDTA 溶液，采用漩涡分散器振荡后，盖上玻盖，于50暗处水浴保温，记录保温时间。 大豆蛋白水解物抗氧化性检测 另取一支普通试管，加入 3ml75%乙醇，100 l 上述混合液， 100 l 1mol/L 的 FeCl2的 1.0mol/LHCl 溶液，100l30%KSCN，采用漩涡分散器振荡后，立即计时，三分钟后用蒸馏水作参比，在480nm 处测定溶液的吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，抗氧化活力 AA（antioxidative activity）可用公式表示： 邻苯三酚方法 原理：试验通过邻苯三酚的自氧化反应产生 O2，研究大豆蛋白水解物对

8、O2的清除能力。邻苯三酚的自氧化机理比较复杂，它在碱性条件下能迅速自氧化、释放出 O2，生成黄色的中间产物，中间产物的累积 3040s 后与时间成线性关系，当有抗氧化剂存在时，可清除 O2，从而阻止中间产物的积累，导致产物颜色较浅，采用分光光度计对产物进行比色分析，可以检测该抗氧化剂清除O2自由基的能力。 步骤：在一系列的试管中加 3ml 0.05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液(pH8.2)，分别加入浓度 2待测大豆肽样品溶液 100l，空白组加入同体积蒸馏水，再加入 100l的 0.45mol/L 邻苯三酚溶液，振荡并计时，待计时至三分钟时立即加入 100l 3%抗坏血酸溶液，振荡，终止反应，在 325nm 处测吸光度 A。以抗氧化剂空白的吸光度为 A0，加抗氧化剂时吸光度为 AS，清除自由基活力 SA（scavengingactivity）可用公式表示：存在的问题 与生产大豆蛋白相比，制备大豆肽需要增加一定量的设备和工艺程序，所以生产成本比较高，价格也比较高，这也是多肽类制品进入市场较困难的主要原因 。 其次，将大豆蛋