线粒体损伤和二苯胺结构在非甾体类抗炎药引起的肝细胞损伤中的作

1、Role of Mitochondrial Dysfunction and Diphenylamine Structure in NSAIDs-induced Hepatocytes InjuryLi yan, Ren jin(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of SciencesAbstract OBJECTIVE: Evaluate the role of mitochondrial function and struct

2、ure of NSAIDs in NSAIDs-induced liver injury. METHODS: The isolated liver mitochondria and primary rat hepatocytes were prepared to perform all the experiments. Diphenylamine was used as a control drug, which had the shared structure of the NSAIDs used in our studies. RESULTS: Diclofenac and tolfena

3、mic acid could induce cyclosporine A (CsA-sensitive mitochondrial swelling, membrane depolarization and calcium release in isolated mitochondria. However, Diphenylamine had no effects on isolated mitochondria. Dpa, Dcf and Tol all induced mitochondrial dysfunction in hepatocytes, including the decre

4、ase of ATP content and mitochondrial membrane depolarization. CsA could attenuate these effects. Meanwhile, we found that SKF-525A, a nonspecific inhibitor of CYP450, could markedly inhibit the injury induced by Dpa, but not Dcf or Tol. CONCLUSION: Dpa itself could not induce mitochondria injury, th

5、e hepatotoxicity induced by Dpa may be related to its metabolism. And the hepatotoxicity caused by diclofenac and tolfenamic acid could attribute to the mitochondrial dysfunction induced by these drugs instead of the effect of the shared diphenylamine structure of these drugs.Key words: Mitochondria

6、, liver injury, NSAIDs线粒体损伤和二苯胺结构在非甾体类抗炎药引起的肝细胞损伤中的作用李妍，任进（药物安全评价研究中心，上海药物研究所，中国科学院，201203）摘要：目的：研究线粒体功能及骨架结构在非甾体抗炎药引起的肝损伤中的作用。方法：采用离体分离得到的线粒体及原代分离的大鼠肝细胞，采用多种分子生物学的方法进行研究。结果：双氯酚酸钠和托灭酸可以导致分离线粒体肿胀，膜电位下降和内钙释放，环孢菌素A可以明显的抑制这一过程。二苯胺对分离线粒体则没有作用。在原代肝脏细胞上，三者均可以引起肝细胞线粒体功能损伤，表现为细胞ATP含量和线粒体膜电位下降，环孢菌素A可以改善这一过程。细

7、胞色素P450非特异性抑制剂可以明显的抑制二苯胺导致的肝细胞损伤，而对双氯酚酸钠和托灭酸的肝细胞损伤作用并不明显。结论：二苯胺本身并不能引起线粒体损伤，它导致的肝细胞损伤可能与其代谢有关，而非甾体类抗炎药双氯芬酸钠和托灭酸引起的肝损伤与线粒体功能异常密切相关，而与其骨架结构二苯胺关系不大。关键词：线粒体、肝损伤、非甾体类抗炎药非甾体类抗炎药（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs）具有抗炎、镇痛和退热功效的功效，广泛应用于风湿性疾病如骨性关节炎、类风湿关节炎等慢性关节炎的治疗，是临床应用最广泛的一类药物。全世界将近有39%的病人使用该类药物1-

8、3。1988年11月到1991年6月，已经有180个案例报道双氯酚酸钠（Diclafenac, Dcf）引起的副作用可能与肝脏损伤有关4。1977到1992年，WHO记录的539起药物副作用反应中，有384起与托灭酸（Tolfenamic acid, Tol）有关5, 6。NSAIDs所引起的肝脏损伤从轻微的胆汁淤积到严重的肝细胞损坏等在临床均有发生7-9。有一些证据表明引发肝损伤的最常见的原因可能是特异体质性疾病并伴随免疫应答症状（如发烧，皮疹和嗜伊红血球增多10-12。近阶段的实验研究在讨论NSAIDs引起的肝损伤的机制时，主要集中在氧化应激、代谢活化和线粒体功能等方面13-16。也有些文

9、献关注于NSAIDs引起的肝毒性与结构有关17-19。有文献报道18种NSAIDs对大鼠原代肝细胞的毒性，结果显示细胞毒较明显的NSADIs中许多具有二苯胺（Diphenylamine, Dpa）的骨架结构。相同浓度的Dpa可以引发与Dcf和Tol相同程度的乳酸脱氢酶的泄漏，Dcf和Tol均含有Dpa的骨架结构。因此，Dpa本身被认为是Dcf, Tol等药物产生肝毒性的部分原因17-19。在我们的研究中，着重探讨Dcf, Tol引起的线粒体损伤作用是否与Dpa的骨架结构有关。我们利用分离得到的大鼠原代肝脏细胞和肝脏线粒体，进而研究三种药物损伤机制的差别。diphenylamine Diclof

10、enac acid tolfenamic acid图 1 二苯胺（Dpa）以及与其结构相关的化合物双氯芬酸钠（Dcf）和托灭酸（Tol）的结构式。一、材料与方法1、材料和大鼠肝脏线粒体的提取双氯芬酸钠、托灭酸、二苯胺购自Sigma，均用二甲基亚砜（DMSO）溶解。 用差速离心方法分离SD大鼠的肝脏线粒体20。1mg线粒体用1ml的溶液重悬。将线粒体调整浓度为1.0 mg线粒体蛋白/mL，重悬于反应溶液中（210 mmolL-1 mannitol，70 mmolL-1 sucrose，5 mmolL-1 Hepes，PH 7.4），30ºC 孵育，视具体实验要求加入不同浓度钙离子溶液。

11、临实验前，加入5 mmolL-1 琥珀酸钠溶液激活线粒体。其他具体实验条件详见图表说明。2 线粒体肿胀检测按1中条件孵育线粒体，检测一定时间内，各种作用因素下溶液A540值的变化，指征线粒体体积变化情况。3、线粒体膜电位检测通过测量TMRE在线粒体上的聚集程度检测线粒体膜电位的变化。参考Wu文献中方法21。1.0 molL-1 CsA作为MPT抑制剂用于该实验中。在激发波长505 nm，吸收波长535 nm处检测荧光值。4、原代大鼠肝脏细胞分离雄性S.D.大鼠，20020g，两步胶原酶灌流法，分离大鼠肝脏细胞，贴壁培养。将细胞浓度调至3×105 cell/ml，37 oC，5CO2贴

12、壁培养4至6小时后弃去培养液，加入含15胎牛血清，100 mgL-1青霉素，70 mgL-1链霉素，2 mgL-1两性霉素和2白蛋白的新鲜培养液（F12/DMEM，11混和），培养4小时后加入不同浓度的药物。5、细胞存活率检测 原代大鼠肝细胞用双氯芬酸钠，托灭酸和二苯胺处理，细胞存活率用Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan检测。6、细胞ATP生物荧光检测ATP生物荧光试剂购自CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability 试剂盒(Promega, MadiMadison,WI, US

13、A。胞内的ATP水平根据试剂盒的要求测定。生物发光用荧光仪读取荧光值 (NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany。7、细胞线粒体膜电位的检测用荧光探针TMRE检测细胞中线粒体膜电位的检测。膜电位的变化用荧光酶标仪仪（NOVOstar, BMG LABTECH, Offenburg, Germany）检测，激发波长为505 nm，发射波长为535 nm。8、统计分析所有数据用均数±标准差（mean±SD）表示，数据计量资料用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差(ANOVA分析，P<0.05示差异有统计学意义。二、结果1. D

14、pa, Dcf, Tol对大鼠肝脏线粒体功能的影响1.1 相同浓度Dpa, Dcf, Tol对大鼠肝脏线粒体肿胀的影响在钙离子存在的情况下，Tol能够引起线粒体大幅度的肿胀，Dcf则引起中等程度的肿胀，而Dpa不能引起线粒体肿胀，MPT特异性抑制剂环孢霉素(cyclosporin A, CsA可以完全抑制Dcf和Tol引起的线粒体肿胀(图2A。同时，Dpa对线粒体膜电位几乎没有影响，而Dcf和Tol均能使线粒体膜去极化，导致膜电位下降(图2B。CsA 可以保护Dcf和Tol所引起的线粒体去极化现象。B图 2 Dpa, Dcf, Tol对大鼠肝脏线粒体的影响。(ADpa, Dcf和Tol对大鼠肝

15、脏线粒体肿胀的影响。(B Dpa, Dcf和Tol对大鼠肝脏线粒体膜电位的影响。各组均为20molL-1Ca2+存在的条件。所有结果均至少重复三次。*P<0.5 和 *P<0.01 表示与对照差异显著。#P<0.01 表示不加CsA组与加CsA组差异显著。+P<0.05 和+P<0.01 表示与50molL-1Dpa差异显著.1.2 相同浓度Dpa,Dcf,Tol对大鼠肝脏线粒体内钙释放的影响我们检测了Dpa,Dcf,Tol对线粒体内钙释放的影响。Dcf可以引起大鼠肝脏线粒体的内钙释放，1molL-1 CsA可以抑制该现象的发生。但是Dpa和Tol无法引起线粒体的

16、内钙释放(图 2。图 3 Dpa, Dcf, Tol对大鼠肝脏线粒体内钙释放的影响。各组均为20molL-1 Ca2+存在的条件。值以平均数±标准差的形式表示。所有结果均至少重复三次。*P<0.01 与对照有显著差异。#P<0.01与不加CsA组有显著差异。+P<0.01 与50molL-1 Dpa有显著差异。2. Dpa, Dcf, Tol对大鼠肝脏细胞的影响2.1 Dpa, Dcf, Tol大鼠原代肝细胞IC50检测用系列浓度的Dpa, Dcf, Tol处理大鼠原代肝细胞，24h后检测细胞活性。Dpa, Dcf, Tol的IC50值分别为183.2±6

17、9.58molL-1, 332.7±31.38molL-1, 195.8±19.60molL-1。2.2 Dpa, Dcf, Tol对大鼠原代肝细胞线粒体功能的影响在原代大鼠肝脏细胞的实验中，三种药物均能引起胞内ATP含量显著下降，其中Dpa的作用最显著(图3A。同时，三种药物均能引起原代大鼠肝细胞膜电位下降(图3B。线粒体通透性转换特异性抑制剂CsA可以明显的抑制三者引起的ATP含量，膜电位下降。SKF-525A是CYP450的广谱抑制剂。SKF-525A可以明显的抑制Dpa引起的肝细胞损伤 (图3C。C图4 Dpa, Dcf, Tol对大鼠原代肝细胞的损伤。大鼠原代肝细

18、胞分别与Dpa, Dcf, Tol共孵育24h，0.5molL-1CsA作为MPT抑制剂。(A Dpa, Dcf, Tol对肝细胞ATP含量的影响。(B Dpa, Dcf, Tol对肝细胞线粒体膜电位的影响。(C SKF-525A对Dpa引起的肝细胞损伤的影响。肝细胞与药物和10molL-1SKF-525A共孵育24h。所有结果均至少重复三次。#P<0.05 和#P<0.01 表示与不加CsA的对照组有显著差异。+P<0.5 and +P<0.01 表示与500molL-1 Dpa有显著差异。 &&P<0.01 表示与250molL-1 Dpa有显

19、著差异。三、讨论在研究中，我们选择了两种具有二苯胺结构的NSAIDs，同时用二苯胺作为对照药物研究三者毒性的差别。在分离线粒体上Dcf, Tol均可以引起明显的线粒体功能损伤，导致线粒体肿胀，膜电位下降和内钙释放，而Dpa则不能引起分离线粒体的损伤。Dcf与Tol引起的损伤可以被MPT特异性抑制剂CsA所抑制，说明Dcf与Tol引起的分离线粒体损伤与MPT有关。在大鼠原代肝脏细胞上，Dpa, Dcf与Tol三者均引起了CsA敏感的肝细胞线粒体功能损伤，表现为细胞ATP含量与膜电位下降，其中Dpa的作用最为显著。而在细胞水平的实验中，需要考虑药物代谢对药物毒性作用的影响。实验中我们使用了CYP4

20、50非特异性抑制剂SKF-525A，发现SKF-525A可以显著的抑制Dpa引起线粒体功能损伤，而对Dcf与Tol的作用不明显。因此我们推测Dpa在细胞水平引起的线粒体功能损伤与其代谢过程密切相关，Dpa本身可能并不能引起线粒体功能损伤，这与Dpa在分离线粒体上的结果一致。综上所述，我们发现NSAIDs导致的肝细胞毒性与其线粒体功能损伤作用密切相关，而它们共有的二苯胺结构在其中的作用可能并不显著。参考文献：1 Johson.A.G.&R.O.Day. The problem and pitfalls of NSAID therapy in the elderly (PART1. Dru

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