第一步分离菌

1、红树林海洋细菌的分离实验材料：分离培养基1. M1培养基：可溶性淀粉0.25%，蛋白胨0.1%，酵母粉0.05%，甘油磷酸钠0.01%，琼脂粉2.0%，人工海水1L，pH值7.27.42. 2216E培养基：Yeast extract 1g，Peptone 5g，FePO4 0.01g，Agar 20g，人工海水1L， pH值7.27.43. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，人工海水1L，pH值7.27.44.称量（除琼脂外的药品）溶化调pH值加入琼脂分装灭菌（121,20min）倒平板实验步骤： 1 样品处理海泥：用50ml无菌人工海水将5g左右的海泥无

2、菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。树根树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3次, 75%酒精浸泡3min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。2样品稀释液的制备分别吸取500µl处理好的各种海泥、树根及树皮等样品的样液，注入盛有4.5ml，无菌人工海水的小试管中，吹吸多次，使充分混匀，然后从

3、此小试管吸取500µl样液注入另一支盛有4.5ml无菌人工海水的小试管中，以此类推，制成10-3,10-4,10-5各种稀释度的样液。2 细菌的分离培养吸取100µl稀释为10-3,10-4,10-5稀释度的样液涂布在M1培养基、2216E培养基、牛肉膏蛋白胨培养基用于分离细菌，并注明稀释度。放于培养箱倒置培养，28,23d。3记录分离到的单菌落。红树林海洋放线菌的分离实验材料：分离培养基1 改良高氏1号琼脂培养基可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂20g，重铬酸钾0.025

4、g，青霉素钠0.002g，人工海水1000ml，pH7.27.4，121灭菌30分钟。2 改良的HV培养基淀粉1g，硝酸钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，氯化钾1.7g，MgSO47H2O 0.05g，FeSO47H2O 0.01g，碳酸钙0.02g，硫胺素0.5mg，核黄素0.5mg，肌醇0.5mg，生物素0.25mg，维生素B6 0.5mg，烟酸0.5mg，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1L，pH值7.27.4, 121灭菌30分钟3 改良的GA培养基葡萄糖10g，牛肉膏1g，磷酸氢二钾0.5g，琼脂20g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海

5、水1L，pH值7.27.4,115灭菌30分钟5. Waksman蛋清蛋白培养基蛋清蛋白0.25g(用0.1N NaOH数毫升溶解)，琼脂20g，FeSO47H2O 0.01g，MgSO47H2O 0.2g，葡萄糖1g，重铬酸钾0.025g，青霉素钠0.002g，人工海水1000ml，pH值6.87.0，121灭菌30分钟实验步骤 51 样品预处理 样品悬浮液的直接制备 海泥：用50ml无菌人工海水将5g左右的海泥无菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。树根树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进

6、行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。SDS法处理 分别称取2g样品(根和皮用无菌剪刀剪碎)，加到20ml含有0.05%的SDS（5mmol/L磷酸盐缓冲液配制）和6%酵母膏的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用CaCl2法处理 分别称取2g样品(根和皮用无菌剪刀剪碎)，加到20ml含有1g/L氯化钙的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,2

7、00r/min)，备用苯酚法处理 分别称取2g样品(根和皮用无菌剪刀剪碎)，加到20ml含有1.5%苯酚的无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用湿热法处理 取直接制备好的样品悬浮液10ml55水浴6min，备用2 稀释涂布a.用移液枪吸取500µl处理好的样品悬浮液，注入另一盛有4.5ml无菌海水的小试管中，依次制成10-3,10-4,10-5稀释液，然后吸取各100µl到改良高氏1号琼脂培养基，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并注明稀释度。b. 用移液枪吸取500µl经SDS处理的样液，制成10-3,10-4,10-5稀释液，然后

8、吸取各100µl到HV培养基、GA培养基、Waksman蛋清蛋白培养基，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并注明稀释度。c. 用移液枪吸取500µl经CaCl2处理的样液，制成10-3,10-4,10-5稀释液，然后吸取各100µl到HV培养基、GA培养基、Waksman蛋清蛋白培养基，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并注明稀释度。d. 用移液枪吸取500µl经苯酚处理的样液，制成10-3,10-4,10-5稀释液，然后吸取各100µl到HV培养基、GA培养基、Waksman蛋清蛋白培养基，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并注明

9、稀释度。e. 用移液枪吸取500µl经湿热处理的样液，制成10-3,10-4,10-5稀释液，然后吸取各100µl到HV培养基、GA培养基、Waksman蛋清蛋白培养基，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并注明稀释度。3.培养将涂布好的培养皿28恒温培养，第二、七、十四天观察，34周可挑菌4纯培养及时将选定的单菌落接入改良高氏1号琼脂平板培养基，进行划线分离培养。5形态分群 记录菌落特征和培养特征红树林海洋真菌的分离实验材料 分离培养基 1改良的Martin培养基：葡萄糖10g，蛋白胨（鱼）5g，磷酸二氢钾1g，新鲜的松树针叶200g，MgSO47H2O 0.5g，琼脂

10、20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121灭菌30分钟2PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121灭菌30分钟3察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，人工海水1L，pH值5.05.5，121灭菌30分钟注：新鲜的松树针叶加水800ml，煮沸1h，双层纱布过滤，弃沉淀，加入含0.1g高锰酸钾的水溶液20ml。实验步骤1 样品处理海水：海水样品用无菌的0.45µm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，滤膜备用。海泥：用50

11、ml无菌人工海水将5g左右的海泥无菌制作成均匀的悬浊液，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。树根树皮：分别取4g左右的树皮和树根，先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 然后进行严格的表面消毒程序，样品依次用30%的过氧化氢浸泡5 min,无菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 无菌水清洗3次, 用滤纸吸干多余的水分，在超静台将其剪成小段，研磨，然后加入到40ml无菌人工海水中，摇床振荡0.5h(28,200r/min)，备用。海泥浸液的制备：取泥样2g研磨，用人工海水做10倍稀释，摇床振荡1h(28,200r/min)，取出用6层纱布过滤，滤液灭

12、菌，备用。植物组织浸液的制备：取根皮各5g用自来水冲洗，再用人工海水清洗、剪碎、研磨，用人工海水做10倍稀释，摇床振荡1h(28,200r/min)，取出用6层纱布过滤，滤液灭菌，备用。2样品稀释液的制备分别吸取500µl处理好的各种海泥、树根及树皮等样品的样液，注入盛有4.5ml，无菌人工海水的小试管中，吹吸多次，使充分混匀，然后从此小试管吸取500µl样液注入另一支盛有4.5ml无菌人工海水的小试管中，以此类推，制成10-1,10-2,10-3各种稀释度的样液。2 涂布培养 a.滤膜直接铺在Martin培养基、PDA培养基、察氏培养基上b.吸取海泥样液100µl到Martin培养基、P