超氧化物歧化酶的体内吸收与超氧化物歧化酶受体

1、    超氧化物歧化酶的体内吸收与超氧化物歧化酶受体        摘要综述了有关肝等细胞内吞SOD过程中的形态学方面的证据和配体印迹等方面的结果，揭示在某些细胞膜表面存在与SOD特异性作用的受体或相关的蛋白质。关键词SOD； 受体； 形态学； 配体印迹中分类号：R977.3文献标识码：A文章编号：1005-8915(2000)03-0184-03 Absorption of SOD and SOD ReceptorHe Huajun, Yuan Qingsheng(Inst

2、itute of Biochemistry，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237)AbstractReview the questions on finding SOD receptor. It is concluded that it has a specific relevant protein interact with SOD on some cellular membrane from the observations of morphologies and immunocytochemistr

3、y，furthermore，the M W of the relevant protein was also obtained.Key WordsSOD receptor, Morphology, Ligand blottingMcCord和Fridovich1首次发表从牛血红细胞中发现超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，E.C.1.15.1.1)活力以来，因为其独特的催化超氧阴离子发生的歧化反应，对维持体内氧自由基的动态平衡具有重要意义。因此人们对其的保健和医学应用进行了许多研究，发现SOD对防御生物体免受氧自由基损伤、抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等方面起着重要

4、作用2。目前，SOD在医药上应用一个突出问题是SOD在血液中的半衰期太短。有几种方法提出用来克服这个问题：与PEG、白蛋白等偶联，或脂质体包裹，或化学修饰，被证实对延长其在血清中的半衰期有效；还有通过基因工程增加SOD的Mr，也可以提高其在血清中的稳定性；甚至在SOD的基因末端融合一段能识别肝素糖蛋白的基因，这样使融合蛋白能定位于内皮细胞3。在试验过程中发现，虽然SOD在血液中因为肾小球的滤过作用，其半衰期很短；但其作用效果可以持续几周甚至几个月4。这让人们对SOD的吸收和作用的机制感兴趣，这是否与SOD能进入细胞内有关?如果能进入细胞内，SOD的Mr为32000，这么大的分子穿过细胞膜是很困

5、难的事情，那么其作用机制又会是什么样的呢?是否如LDL(低密度脂质体)一样，存在特异性受体呢?本文按不同研究的手段和方法，综述了肝细胞等对SOD的结合和内吞的形态学研究以及配体印迹等手段对其受体研究的假设和深入研究情况。1荧光标记Mondola等5培养BLA-3A细胞(Buffalo鼠肝细胞)，用2mg/ml的FITC-SOD(异硫氰酸荧光盐-SOD)在4与其结合30min，荧光显微镜观察可见细胞表面有荧光存在；而用20倍未标记SOD预结合的平行实验在细胞表面未见荧光出现。可见FITC-SOD能与细胞膜结合，而且未标记SOD能竞争此反应。袁勤生等6把FITC-SOD加入牛主动脉内皮细胞培养液中

6、进行培养，荧光结果显示标记物进入了培养细胞内。Emerit等4用流式细胞仪方法，5%的胎牛血清避免非特异性结合，结果显示对培养细胞的自由基损伤的保护效应与FITC-SOD结合到细胞膜表面有关。培养全血细胞除红细胞外(淋巴细胞、单核细胞和中性白细胞)均出现荧光，且标记程度与FITC-SOD的浓度和结合时间有关。成纤维细胞也观察到这种现象。FITC-SOD仅仅是结合在细胞的表面还是进入了细胞内?该实验中还用共焦显微镜证实FITC-SOD进入了单核细胞的细胞质。在该实验中找到了SOD特异性结合的证据：(1) 细胞松弛素B(一种内吞抑制剂)预处理，可见细胞上的荧光标记减少，但并不完全抑制，结合位点看来

7、对SOD是特异性的；(2) 5%的胎牛血清预处理，不竞争SOD的结合反应，细胞依然显示荧光；(3) 用FITC标记的羊抗鼠IgG温育，未见荧光出现，可见胎牛血清并没有特异性进入。2胶体金标记Dini等7培养大鼠肝细胞，与Au5或Au17标记的SOD复合物温育，结合实验采用015min，内化实验采用3760min，非特异性吸附的平行实验用2×10-4 mmol/LSOD或0.4%BSA(牛血清白蛋白)证实SOD的结合是特异性的，因为BSA不抑制SOD与细胞膜的结合，而用未标记的SOD以抑制标记物的结合；另外，两种不同表面电荷的SOD(绵羊SOD，pI=8，牛血SOD，pI=5)同样能结

8、合到膜上。SOD的内化实验表明：SOD内化前随机结合在细胞膜上有一个结合位点的构象重排过程，这种现象是一种典型的受体介导内吞的现象7。该研究组还进行了Au5或Au17标记的牛血SOD与Wistar大鼠肝作用的在体(in situ)和体内(in vivo)实验3。非特异性吸附的平行实验用2×10-4mol/mlSOD或0.4%BSA。实验发现Au17-SOD复合物出现在肝细胞、内皮细胞和枯氏细胞的表面，而Au17-BSA在肝细胞中不出现，仅在内皮细胞和枯氏细胞的表面有10%。2×10-4mmol/LSOD抑制细胞与Au17-SOD结合，而0.4%BSA不影响结合。电镜显示Au

9、17-SOD复合物存在于细胞内的小泡中。肝似乎可以积累外源SOD，而肾吸收Au17-SOD复合物的速率远远低于肝，心脏未见Au17-SOD的吸收，故肝可能是从血液中清除外源SOD的主要场所。结果还证实：Au17-SOD优先于枯氏细胞和内皮细胞结合，内皮细胞首先积累随后释放给肝细胞。该组的结果9还证实：在体外，在体和体内的各种模型实验中，发现年老的鼠的结合和内化速率都明显降低，因此，SOD用于治疗年老有关的疾病时需重新评价，应考虑到SOD的内吞机制与衰老相关。3放射性标记Simone等10用125I-SOD静脉注射Wistar大鼠，通过梯度和等密度离心，发现125I-SOD能快速被肝吸收，而且其

10、作用至少可达150min。证实SOD吸收并积累在细胞内，在溶酶体中能存在一段较长的时间。这也许从另一个方面说明SOD的作用的持久性。Mondola等5用BRL-3A细胞，与50200g/ml125I-SOD4温育1h，用20倍过量的未标记SOD作抑制实验。实验标明150g/ml125I-SOD使细胞表面达饱和。125I-SOD与BRL-3A细胞结合Scatchard作分析，得到Bmax=145ng，Kd=69g/ml。4酶活力Edeas等11150U/ml的SOD与PBLs(外周血淋巴细胞)温育1h，可使其SOD活力提高1倍，而与热失活的SOD温育24h也无作用。而且在0300 U/ml范围内

11、，随外加SOD活力单位的增加，PBLs的活力增加。Kyle等12对用甲胺、莫能菌素、苯甲醇、细胞松弛素B和寡霉素等内吞抑制剂，发现能消除SOD对培养肝细胞的保护作用，肝细胞与SOD温育1h，能使SOD活力升高4倍，每一种抑制剂均能降低这种与细胞有关的活力变化。真核细胞能连续地内化其细胞表面，因此外源的大分子物质可通过这种细胞膜的循环而内化，HRP(辣根过氧化物酶)被认为是这种液相胞饮过程(fluid phase process)的合适标记物13。该实验中证实温育SOD和HRP1h后，其内化量前者是后者的200倍。因此肝细胞内吞SOD不仅仅是一种细胞膜连续循环的产物，与HRP的内化机制不一样；而

12、且对内吞抑制剂甲胺的敏感度，SOD远远敏感于HRP，因为甲胺对液相胞饮的速率影响很小。可见SOD内化与细胞膜的特异性结合有关。5免疫细胞化学Dini等14用培养的Wistar大鼠肝细胞与1mg/ml的未标记重组SOD37分别温育15min，30min，60min，用电镜定位内化SOD，固定切片，切片与抗hSOD的单抗温育过夜，免疫金标染色。非特异性吸附的对照实验单独用抗血清蛋白A与Au17标的复合物或者与未偶合的蛋白A预温育。电镜免疫金染色实验证实了hSOD的结合与内化。结合试验时，hSOD抗体的正反应定位于肝细胞表面，内化实验显示hSOD进入了核内体。当与胶体金标的蛋白A温育，可见非常少的非

13、特异性结合和进入了细胞内，这可能与液相胞饮有关。用未标记SOD实验的结果消除了因为金复合物蛋白质造成的假象的可能性。Edeas等11对培养PBLs的培养液里分别加入0U，50U，100U，150U和300U的未标记的外源牛血SOD，温育24h，然后充分冲洗，加入120稀释的绵羊抗人Cu*Zn-SODIgG，和绵羊抗人Mn-SODIgG(绵羊抗人Cu*Zn-SODIgG，和绵羊抗人Mn-SODIgG与Cu*Zn-SOD及Mn-SOD之间没有交叉反应)，然后用1100HRP标的兔抗绵羊IgG温育，染色。结果显示：外源SOD穿过了细胞膜，而且其定位靠近核膜，可能在核膜上也有SOD的结合位点存在。6配

14、体印迹Mondola等5制备BRL-3A细胞膜，行未变性SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上，充分冲洗后，1份与125I-SOD温育，另1份除125I-SOD外加20倍过量的未变性SOD温育过夜，放射自显影，发现在约Mr1320000处有一清晰的条带。可见在细胞膜表面存在有与SOD特异性相互作用的受体或其它蛋白质。从形态学及配体与受体的相互作用看出：SOD可以特异性进入细胞内，且用125I-SOD与细胞膜相互作用得到其Bmax和Kd；另外，用配体印迹的方法得到有一与125I-SOD相互作用的约Mr 320000的蛋白质。那么在某些细胞表面是否存在SOD受体呢?可以肯定在肝细胞等细胞表面存

15、在与外源SOD特异性相互作用的蛋白质，但是否就是SOD受体呢?可能是SOD受体或者对SOD也有作用的其它受体或蛋白。目前，仍没有分离纯化到SOD受体的报道，因为受体仅占细胞膜总蛋白的一小部分，分离纯化困难，亲和层析有可能因为改变了配体与受体相互作用的位点而使分离纯化变得困难。相信在不久的将来，可望用表达克隆法15或酵母双杂交系统16从基因库中调出与SOD相互作用蛋白的基因。到时就可阐明对SOD吸收、利用的机制，为SOD的应用建立坚实的理论基础。贺华君（华东理工大学生物化学研究所，上海 200237）袁勤生（华东理工大学生物化学研究所，上海 200237）参考文献1，McCord，J M，Fri

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